肝臟特異HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及表型分析

文川，賽巖，白紀(jì)民，劉勇，常菁，王智，崔春萍

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是居全球第 5 位的常見腫瘤，是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病[1]。近年來研究表明，原發(fā)性肝癌發(fā)病率呈上升趨勢，2010年數(shù)據(jù)顯示我國每年死于肝癌的人數(shù)約 34.4萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的55%。肝癌切除后易復(fù)發(fā)，對化療藥物不敏感，缺乏有效的系統(tǒng)治療策略，且在治療過程中容易產(chǎn)生耐藥和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致治療失敗。因此，深入研究肝癌發(fā)病機(jī)制并發(fā)展新的治療策略是關(guān)系人類健康的重大科學(xué)問題。

HPPCn（Hepatopoietin Cn）是本室從新生小牛肝臟中分離得到的一種新型肝細(xì)胞刺激因子[2]，在肝癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，在肝癌患者的癌組織和血清中表達(dá)呈陽性。前期研究發(fā)現(xiàn) HPPCn能夠特異促進(jìn)肝細(xì)胞的DNA 合成和肝臟再生。為了進(jìn)一步對HPPCn的功能進(jìn)行研究，我們構(gòu)建了攜帶小鼠白蛋白啟動(dòng)子（Alb promoter）和增強(qiáng)子序列的HPPCn肝臟特異性表達(dá)載體，并獲得了肝臟高表達(dá)HPPCn的轉(zhuǎn)基因鼠，為研究 HPPCn 在肝癌發(fā)生過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡 SPF 級 FVB/N 小鼠，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)用小鼠均在SPF 級動(dòng)物房飼養(yǎng)和繁殖。溫度控制在22 ℃，濕度 70 %，自動(dòng)光控（12 h 明/12 h 暗），自由采食和飲水。

1.1.2 主要試劑 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DL2000、Xhol I、Not I、BamH I、Pst I 購自中國寶生物工程（大連）有限公司；DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國 Qiagen公司；T4DNA連接酶、熒光定量 PCR 反應(yīng) Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PVDF 雜交膜購自美國 Amersham公司；Hybond+尼龍膜購自美國 Millipore公司；抗 HPPCn 單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室自制；地高辛標(biāo)記試劑盒購自美國羅氏公司；TRIzol 試劑購自美國 Invitrogen公司；基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；所有引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 攜帶 HPPCn 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠的制備 將 pGEX 載體中的CMV 啟動(dòng)子替換為A1bumin 啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列。該質(zhì)粒是在限制性內(nèi)切酶 Xho I、Not I 之間插入了帶有 7個(gè)組氨酸標(biāo)簽的HPPCn，即為重組質(zhì)粒 pGEM-A1b/his-HPPCn。采用質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定 750 bp目的HPPCn 條帶。重組質(zhì)粒 pGEM-A1b/his-HPPCn 用限制性內(nèi)切酶 Apa I和Mlu I 切除其中的原核細(xì)胞 DNA 片段部分，把可以在真核細(xì)胞中表達(dá)的大片段包括 A1bumin promoter，enhancer，his-HPPCn，SV40 PolyA 尾回收供注射，片段大小約為4 kb。將回收的線性化重組片段（3～5 ng/μl）顯微注射到 FVB/N 小鼠的受精卵中[3]，并將此受精卵植入假孕 FVB/N 母鼠輸卵管中，制備首代轉(zhuǎn)基因小鼠。將已鑒定的首代轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型FVB/N 鼠配種，對產(chǎn)生的子代鼠基因組進(jìn)行 PCR鑒定。

1.2.2 PCR和Southern blot 鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠 小鼠出生后的第 10 天剪下 2～3 mm的鼠尾，提取小鼠基因組，PCR 法檢測小鼠基因型。上游引物為：5' CAAATGGGAGACAAAGAG 3'，下游引物為：5' AGATGCGTGAGGTTCG 3'。PCR 反應(yīng)體系 20 μl，反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min 后開始擴(kuò)增循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，共 32個(gè)循環(huán)。目的基因 A1b-HPPCn 片段為650 bp。

PCR 陽性小鼠基因組10 μg 用 EcoR I 酶切2 h 后經(jīng) 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)印至Hybond+尼龍膜，然后用 PCR 擴(kuò)增重組質(zhì)粒pGEM-A1b/his-HPPCn的650 bp 片段為探針，按高效 DNA 地高辛標(biāo)記和檢測試劑盒說明書進(jìn)行Southern blot 檢測。

1.2.3 Western blot 檢測 His 標(biāo)簽和HPPCn的表達(dá) 提取轉(zhuǎn)基因陽性小鼠和同窩陰性小鼠肝臟組織總蛋白，蛋白定量后，進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳（10% 濃度凝膠），蛋白經(jīng)半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，置于5% 脫脂牛奶中封閉，一抗用抗HPPCn 單克隆抗體、抗 His 標(biāo)簽抗體，二抗用山羊抗小鼠抗體檢測 HPPCn蛋白和His-HPPCn蛋白表達(dá)。

1.2.4 Realtime-PCR 檢測 HPPCn mRNA的表達(dá) 用 TRIzol 試劑提取轉(zhuǎn)基因陽性小鼠和同窩陰性小鼠肝臟組織總 RNA，并以之為模板進(jìn)行RT-PCR，以所得 cDNA 為模板進(jìn)行 Realtime-PCR，HPPCn 上游引物為：5' ACGCCCTCTGATGT GAAA 3'，下游引物為：5' TTCTGCCAATGCTTCC AC 3'，GAPDH 上游引物為：5' GGATTTGGTCGTA TTGGG 3'，下游引物為：5' TCGCTCCTGGAAGAT GG 3'。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性 5 min，95 ℃ 變性 15 s，58 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 15 s，反應(yīng)共 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束統(tǒng)計(jì) CT 值，查看溶解曲線圖，以公式：相對表達(dá)量=1.5-△△ct統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.5 組織學(xué)檢測 選用 4 月齡左右的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔取出肝臟，將部分肝臟組織固定在福爾馬林中48 h，進(jìn)行脫水、包埋、切片，HE 染色。另取小塊肝臟組織固定在2.5%的戊二醛溶液中，制成透射電鏡切片。

2 結(jié)果

2.1 高表達(dá) HPPCn 轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

限制性內(nèi)切酶 XhoI、NotI 分別酶切 pGEM載體（圖 1）和擴(kuò)增的his-HPPCn 片段，將其連接轉(zhuǎn)化后，提取質(zhì)粒進(jìn)行 PCR 鑒定（圖 2）并對構(gòu)建好的載體進(jìn)行基因測序，證明 pGEM-Alb/his-HPPCn 載體構(gòu)建是正確的。我們用 Apa I、Mlu I 對轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體進(jìn)行酶切（圖 3），目的是從轉(zhuǎn)基因載體上切下目的基因的片段和肝臟特異表達(dá)所需的特異性的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。將所需的片段切下后回收供顯微注射。PCR（圖 4）和Southern blot（圖 5）鑒定產(chǎn)生的小鼠基因組型，共產(chǎn)生 2只首建鼠，均可傳代。現(xiàn)已成功繁殖到 F4 代，并未出現(xiàn)外源基因的丟失。

圖1 載體的酶切Figure1 Identification of pGEM by restriction enzyme digestion

圖2 目的片段的擴(kuò)增Figure2 Identification of his-HPPCn fragment by PCR

圖3 注射用片段的鑒定Figure3 Identification of micro-injection fragment

圖4 轉(zhuǎn)基因小鼠 PCR 鑒定Figure4 Identification of transgenic mice by PCR

圖5 轉(zhuǎn)基因小鼠 Southern blot 鑒定Figure5 Identification of transgenic mice by Southern blot

圖6 HPPCn和His 標(biāo)簽在轉(zhuǎn)基因陽性和陰性小鼠肝臟中的表達(dá)Figure6 The expression of HPPCn and His gene in liver tissues of wild type mice and transgenic mice

2.2 HPPCn 在轉(zhuǎn)基因陽性和陰性小鼠肝臟中的表達(dá)

提取 4 月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和陰性小鼠肝臟組織總蛋白，Western blot 分析HPPCn和His 標(biāo)簽在肝臟組織的表達(dá)。結(jié)果顯示，所檢測蛋白均顯著上調(diào)（圖 6）。

提取 4 月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和陰性小鼠肝臟總RNA，Realtime-PCR 分析 HPPCn 基因的mRNA在肝臟中的表達(dá)。結(jié)果顯示，在mRNA 水平上有顯著上調(diào)（圖 7）。

圖7 HPPCn 在轉(zhuǎn)基因陽性和陰性小鼠肝臟中 mRNA 水平表達(dá)Figure7 The expression of HPPCn mRNA in liver tissues of wild type mice and transgenic mice

2.3 高表達(dá) HPPCn 轉(zhuǎn)基因小鼠組織病理學(xué)檢測

將 4 月齡的高表達(dá) HPPCn 轉(zhuǎn)基因陽性和陰性小鼠的肝臟和肺臟進(jìn)行病理解剖，HE 染色和透射電鏡觀察。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因陽性和陰性的肝臟和肺臟細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，亞顯微結(jié)構(gòu)中轉(zhuǎn)基因陽性小鼠肝臟線粒體發(fā)生明顯空泡化并且線粒體數(shù)量增多（圖 8）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建了肝臟高表達(dá) HPPCn 轉(zhuǎn)基因小鼠，在蛋白和分子水平上均顯示 HPPCn 含量明顯上調(diào)，為后期建立評價(jià) HPPCn 在體內(nèi)肝癌發(fā)生發(fā)展中的功能作用提供了有力工具。

圖8 轉(zhuǎn)基因陽性和陰性小鼠肝臟和肺臟組織切片 HE 染色和電鏡觀察Figure8 The sections of liver and lung tissues from the wild type mice and the transgenic mice were stained with HE and observed by TEM

本實(shí)驗(yàn)中，我們著重對比了導(dǎo)入外源基因后FVB/N 小鼠與野生型 FVB/N小鼠之間的表型變化。首先，在外觀上，體型、毛發(fā)、體重等方面未發(fā)現(xiàn)明顯不同。我們對肝臟切片做了 HE 染色，在細(xì)胞排列方式、細(xì)胞形狀以及細(xì)胞核數(shù)量等方面進(jìn)行比較，也未發(fā)現(xiàn)兩種小鼠之間有明顯的改變。并且，我們對兩種小鼠血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）含量進(jìn)行了測定，其含量均在正常范圍內(nèi)。其次，我們對肝臟切片做了透射電鏡觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)的線粒體數(shù)量明顯增多，有空泡化現(xiàn)象，這種結(jié)果可能會(huì)影響肝臟能量代謝。之后，對于這種現(xiàn)象我們對兩種小鼠做了長時(shí)間的觀察和對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論從運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、精神狀況、飲食情況以及小鼠壽命等均未出現(xiàn)明顯區(qū)別。最后，采用 Western blot和Q-PCR 檢測兩種小鼠肝臟內(nèi) HPPCn 表達(dá)水平時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi) HPPCn能持續(xù)性的高于正常水平表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)采用的建模小鼠是 FVB/N 小鼠，F(xiàn)VB/N 小鼠是常用的轉(zhuǎn)基因模型鼠，因?yàn)樗姆敝衬芰^強(qiáng)，生育的子代數(shù)量多，受精卵前核大而顯著，易于外源 DNA的注射。我們設(shè)計(jì)的重組DNA 片段含有白蛋白增強(qiáng)子和白蛋白啟動(dòng)子以及具有 His 標(biāo)簽的HPPCn 片段。小鼠白蛋白主要在肝臟中表達(dá)，并在早期胚胎發(fā)育過程中開始表達(dá)[4]。其啟動(dòng)子包含 CAATbox和TATAbox 及肝細(xì)胞核因子（HNF1）結(jié)合域[5]，在進(jìn)化史上具有高度保守性[6]。構(gòu)建含有 cDNA 序列與外源啟動(dòng)子結(jié)合的重組質(zhì)粒以獲得轉(zhuǎn)基因目的片段是建立轉(zhuǎn)基因小鼠的手段之一[7]。本室研究人員構(gòu)建了 Alb 啟動(dòng)子啟動(dòng)的帶有 His 標(biāo)簽的HPPCn 真核表達(dá)載體，并成功在體外對該載體肝臟表達(dá)的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。進(jìn)而我們將載體上的白蛋白增強(qiáng)子、啟動(dòng)子及目的基因片段切下后通過顯微注射方式注射到受精卵原核中，再植入假孕母鼠的輸卵管中，對產(chǎn)生的子代小鼠進(jìn)行鑒定。

對于本實(shí)驗(yàn)中篩選轉(zhuǎn)基因陽性鼠需要的PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)，考慮到 HPPCn的內(nèi)源性基因，我們設(shè)計(jì)了可特異地檢測轉(zhuǎn)入片段的精確引物，并為了驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，我們把轉(zhuǎn)入的片段用陰性小鼠基因組稀釋 2萬倍（按照一個(gè)重組片段在小鼠基因組中所占的比例）后仍然能擴(kuò)增出目的片段，并以此稀釋液作為陽性對照。轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定至少需要兩次剪尾，并 PCR 鑒定結(jié)果一致才能確定，避免有假陽性結(jié)果。

HPPCn是富含亮氨酸的酸性殼蛋白，屬于LANP 家族，同屬于LANP 家族的還包括 pp32、PHAPI、Mapmodulin、I1PP2A、APRIL、pp32r1和pp32r2等，這些蛋白都參與細(xì)胞的自我更新過程，并且在一些腫瘤組織中表達(dá)較高[8-9]，HPPCn 在正常肝組織中表達(dá)量較低，經(jīng)肝部分切除或誘發(fā)性肝損傷時(shí)，HPPCn的表達(dá)上調(diào)。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均表明 HPPCn能刺激肝細(xì)胞的增殖[10]。本實(shí)驗(yàn)是基于這些研究成果，從而構(gòu)建了高表達(dá) HPPCn 轉(zhuǎn)基因鼠，期望對 HPPCn 在肝臟疾病中所發(fā)揮的作用做更深入的研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)成功建立了肝臟特異 HPPCn 高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，為進(jìn)一步研究 HPPCn的功能和作用機(jī)制提供了有力工具。

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