海洋生物活性藥物對(duì)細(xì)胞周期與凋亡的調(diào)控在抗腫瘤治療中的作用

齊相薇，張湘寧，黃培春

作為生命的發(fā)源地，海洋具有豐富的生物多樣性。多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物（如貝類(lèi)和海綿類(lèi)）不具有天然抵抗力，即內(nèi)在免疫系統(tǒng)，需要合成具有生物學(xué)活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物以獲得相應(yīng)的功能。這些代謝產(chǎn)物在保護(hù)宿主的生存和適應(yīng)極端環(huán)境方面起著重要的作用，也是近年來(lái)藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。由海洋生物提取、制備的抗癌藥物作用于惡性細(xì)胞的標(biāo)志性特征被歸納為：①易于對(duì)生長(zhǎng)信號(hào)滿(mǎn)足；②對(duì)拮抗生長(zhǎng)的信號(hào)產(chǎn)生的效應(yīng)不敏感；③對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的逃避；④不受限制的增殖能力；⑤持續(xù)的新生血管生成；⑥具有浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的能力[1]。

本文擬從藥物對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與增強(qiáng)作用兩方面討論目前已開(kāi)發(fā)的海洋生物藥物的抗癌活性，并對(duì)正處于研發(fā)階段的藥物可能的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行探討。

1 對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用

細(xì)胞周期是一個(gè)被緊密控制和協(xié)調(diào)組織的過(guò)程，調(diào)控著細(xì)胞的生存，該過(guò)程的紊亂，可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞死亡。細(xì)胞周期由一個(gè)時(shí)相進(jìn)展到下一時(shí)相，受到檢查點(diǎn)的控制，DNA 損傷的刺激，激活 p53 的表達(dá)，作用于檢查點(diǎn)機(jī)制，啟動(dòng)周期阻滯、DNA 修復(fù)和細(xì)胞凋亡[2]。

癌細(xì)胞對(duì)負(fù)性生長(zhǎng)調(diào)控與抗增殖信號(hào)的逃避在惡性增殖中起著重要的作用。pRb 蛋白功能的喪失，影響到抗增殖信號(hào)的發(fā)放，使癌細(xì)胞不再受到負(fù)性的調(diào)控。突變和組成性磷酸化都可以造成 Rb 調(diào)控環(huán)路的失活。Rb 的非磷酸化或低磷酸化都能抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展和細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞在活躍增殖的過(guò)程中，周期蛋白使 Rb 高磷酸化能有效去除這種阻遏作用。使 Rb 蛋白質(zhì)組成型磷酸化的藥物，在癌細(xì)胞中能有效地重建受控的生長(zhǎng)與增殖。

源于海洋的天然花柏烷型倍半萜 dactylone 與某些可食赤藻的次級(jí)代謝物具有結(jié)構(gòu)和功能的相似性。研究結(jié)果表明，dactylone 及結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物能減少惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖[3]。該藥物在非毒性劑量時(shí)可有效預(yù)防腫瘤的發(fā)生，其機(jī)制是通過(guò)抑制 cyclin D3、細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶 4（cyclin-dependent kinase，CDK4）的表達(dá)和 Rb 的磷酸化從而阻滯腫瘤細(xì)胞由 G1期進(jìn)展到 S 期，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)海綿類(lèi)海洋生物的研究證實(shí)，其活性成分通過(guò)作用于細(xì)胞周期的不同環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用。Petrosia sp.海綿中分離到的聚乙炔醇 dideoxypetrosynol A可通過(guò)誘導(dǎo) CDK 的抑制物 p16，并下調(diào) pRb 的磷酸化，抑制人類(lèi)單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系 U937 的生長(zhǎng)[4]。來(lái)自海綿mycalehentscheli 的化合物 peloruside 可抑制 Ha-ras 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡，并將發(fā)生腫瘤基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞阻滯于 G2/M 期。軟海綿素類(lèi)（halichondrin）能抑制微管蛋白的多聚化，在對(duì)人肺腺癌 A549 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，該化合物通過(guò)上調(diào)生長(zhǎng)阻滯與 DNA 損傷誘導(dǎo)蛋白 45（growth arrest and DNA 45 damage-inducible protein 45，GADD45），并下調(diào) c-Myc 蛋白的水平將細(xì)胞周期阻滯于 G2/M 期[5-6]。Agelas 屬的海綿 axinella sp.和繁茂膜海綿均富含溴化吡咯類(lèi)生物堿。據(jù)報(bào)道，這類(lèi)化合物都具有抗腫瘤的活性。Xiong 等[7]分離了一種新型的溴化吡咯生物堿—— N-(4,5-二溴-吡咯-2-羰基)-L胺基異戊酸甲酯（B6）。B6 能在體外抑制各種腫瘤細(xì)胞的增殖，其中對(duì) LOVO 和HeLa 最為明顯。在小鼠移植瘤模型中，也有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。B6 處理的細(xì)胞被阻滯于 G1期，并發(fā)生細(xì)胞凋亡。B6 還能促進(jìn) Ca2+的釋放，而胞內(nèi) Ca2+濃度升高與細(xì)胞凋亡相關(guān)。

E7974 是一種海綿天然產(chǎn)物哈米特林的人工合成類(lèi)似物，針對(duì)微管蛋白的抗有絲分裂機(jī)制發(fā)揮藥物活性，對(duì)純化微管蛋白多聚化的抑制強(qiáng)度與長(zhǎng)春新堿相當(dāng)，在培養(yǎng)細(xì)胞中，可誘導(dǎo) G2/M 期阻滯，類(lèi)似于靶向微管蛋白的抗癌藥物，可明顯干擾有絲分裂時(shí)紡錘絲的合成。組織細(xì)胞淋巴瘤U937 細(xì)胞經(jīng) E7974 處理后，大量亞二倍體細(xì)胞出現(xiàn)，提示 G2/M 期阻滯后，細(xì)胞凋亡啟動(dòng)。E7974 短暫作用就可誘導(dǎo)大量的有絲分裂阻滯，提示即使血藥濃度下降之后，其仍然能夠發(fā)揮抗癌活性[8]。

人類(lèi)染色體 3 短臂的一個(gè)在腫瘤組織經(jīng)常丟失的區(qū)域3p21 上聚集著多個(gè)候選抑癌基因，其中的 BLU/ZMYND10在鼻咽癌組織和培養(yǎng)細(xì)胞中因啟動(dòng)子甲基化表達(dá)沉默。根據(jù)我們待發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BLU 基因在鼻咽癌細(xì)胞重建表達(dá)時(shí)，該基因的表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)調(diào)控 JNK 活性下調(diào) cyclin D1活性，阻滯靶細(xì)胞的周期運(yùn)行。用海洋生物蝦蛄的提取物處理腫瘤細(xì)胞可觀察到細(xì)胞周期阻滯。處理的細(xì)胞收獲后，以流式細(xì)胞儀分析 DNA 含量，結(jié)果提示細(xì)胞周期阻滯在 S期，且 S 期細(xì)胞數(shù)的改變?yōu)樗幬餄舛纫蕾?lài)式。細(xì)胞周期阻滯伴有增殖期胞核抗原（PCNA）增高，PCNA 的改變也表現(xiàn)為藥物濃度依賴(lài)式。

2 對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用

腫瘤細(xì)胞通過(guò)不同的機(jī)制獲得對(duì)細(xì)胞凋亡的抗性，這些機(jī)制包括抑癌基因 p53 的突變滅活。海洋藥物對(duì)PI3K/AKT/PKB 抗凋亡活性具有明顯的抑制作用，一些藥物還能增強(qiáng) Fas 死亡信號(hào)。

胱天蛋白酶（caspase）依賴(lài)的細(xì)胞凋亡通路，是許多抗癌藥物針對(duì)的靶點(diǎn)[9]。人類(lèi)細(xì)胞中，存在兩條細(xì)胞凋亡的通路：①細(xì)胞應(yīng)激觸發(fā)的內(nèi)源性凋亡通路，此過(guò)程由藥物等應(yīng)激因素誘導(dǎo)，線粒體通透性增高，釋放出促凋亡因子，激活caspase-9，進(jìn)而活化下游的 caspase，最終宿主細(xì)胞發(fā)生程序性死亡；②死亡受體 Fas 或其他腫瘤壞死因子受體激活的外源性通路，caspase-8 在此過(guò)程中活化。兩條途徑均可引起相同的活化過(guò)程，該過(guò)程需要 caspase-3 和 caspase-7的蛋白水解活化[10]。細(xì)胞色素 C 的釋放啟動(dòng)內(nèi)源性的凋亡通路激活時(shí)，Bax/Bak 插入線粒體膜，導(dǎo)致其通透性的升高，從而使多種多肽分子，如細(xì)胞色素 C、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、內(nèi)切酶 G（EndoG）、Smac/DIABLO 和 HtrA2/Omi 釋放到胞漿，啟動(dòng)凋亡通路的活化。在外源性凋亡通路中 caspase-8通過(guò)水解作用，使一個(gè)含有 BH3 結(jié)構(gòu)域的 Bcl-2 家族蛋白—— Bid 降解活化。Bid 活化后激活 caspase-9，導(dǎo)致線粒體通透性增高，釋放細(xì)胞色素 C 至胞漿（圖 1）。目前caspase 和 IAP 家族蛋白都已成為抗癌治療的重要靶點(diǎn)。

圖1 細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性和外源性途徑[11]

2.1 DNA 損傷引起依賴(lài)于線粒體的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路

多數(shù)常規(guī)的抗癌治療針對(duì)的是線粒體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡途徑的間接激活，在耐藥的腫瘤細(xì)胞中此途徑經(jīng)常出現(xiàn)缺陷[12]?？鼓[瘤藥物在發(fā)揮治療作用時(shí)，通常針對(duì)靶細(xì)胞的胞核 DNA，I 型和 II 型拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑屬于這類(lèi)藥物。II 型拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的化療藥物 etoposide 通過(guò)作用于線粒體膜，使通透性升高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們?cè)?jīng)報(bào)道，EB 病毒編碼的轉(zhuǎn)化基因產(chǎn)物 LMP 能增加 etoposide 誘導(dǎo)的 capsase-3 活性[13]。

抑癌蛋白 p53 在 DNA 損傷和細(xì)胞凋亡的發(fā)生過(guò)程的偶聯(lián)中起著關(guān)鍵作用。DNA 損傷可誘導(dǎo)胞內(nèi) p53 水平的升高，誘導(dǎo)胞內(nèi) Bcl-2 家族促凋亡成員合成增加。Bcl-2家族促凋亡成員 Bax、Bak、Noxa 和 Puma 與抗凋亡成員Bcl-2、Bcl-X、Mcl-1 濃度比例的改變影響線粒體膜的通透性，決定著細(xì)胞對(duì)線粒體途徑凋亡的敏感性。有實(shí)驗(yàn)室還報(bào)道，一個(gè)啟動(dòng)型 caspase —— caspase-2 也控制著線粒體通透性的增加和促凋亡因子的釋放[14-16]。

片螺素（lamellarins）是一族來(lái)源于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的六環(huán)吡咯生物堿，具有抗腫瘤活性[17]。其中 lamellarin D 對(duì)一系列腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，在 10-6mol/L 濃度水平，就能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡[17-19]。該藥物的促凋亡活性有幾種可能的機(jī)制。Lamellarin D 具有抑制胞核拓?fù)洚悩?gòu)酶 I的活性，對(duì)于 DNA 的切割效率稍弱于經(jīng)典的拓?fù)洚悩?gòu)酶 I抑制物 campthotecin[20-21]。結(jié)構(gòu)-活性研究顯示，lamellarin D衍生物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 的抑制作用與其毒性存在良好的相關(guān)性，提示胞核是 lamellarin D 促凋亡作用的靶點(diǎn)。然而，拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 突變的腫瘤細(xì)胞對(duì)于 lamellarin D 并不完全耐藥，提示它對(duì)于細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)能力也可能依賴(lài)于胞內(nèi)的其他成分。Lamellarin D 及其衍生物能直接地增加線粒體膜的通透性，其發(fā)放的信號(hào)可誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路的啟動(dòng)，引起 Bax 的活化，降低抗凋亡蛋白 Bcl-2 和 cIAP 活性，同時(shí)激活 caspase-3 和 caspase-9。Lamellarin D 誘導(dǎo)細(xì)胞色素 C 的釋放并不依賴(lài)于胞核因子。這些結(jié)果提示，lamellarin D 還能以不依賴(lài)于核信號(hào)的方式，通過(guò)細(xì)胞凋亡的線粒體途徑發(fā)揮細(xì)胞毒性[22]。

水生生物堿（ASC）是一種來(lái)源于海鞘 didemnum sp.[23]和 cystodytes dellechiajei[24]的五環(huán)芳香族生物堿，在體外對(duì)人類(lèi)結(jié)腸癌、乳腺癌和白血病細(xì)胞具有顯著的毒性，而且對(duì)于藥物敏感和多藥耐受的細(xì)胞系幾乎具有同樣的毒性，被認(rèn)為是一種十分有前景的耐藥腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒因子[25]。Dirsch等[26]報(bào)道，ASC 可激活caspase-2，導(dǎo)致線粒體途徑的激活。由于 caspase-2 的活化先于 casapse-8、-9、-3 的切割活化，因此，caspase-2 抑制劑 zVDVAD fmk 可完全阻斷 ASC誘導(dǎo)的 DNA 片段化，Bcl-x(L) 過(guò)度表達(dá)能阻斷 caspase-8的活性，但不能阻斷 caspase-2 的活性。相反，casapse-2 抑制對(duì) caspase-9 的活化起到強(qiáng)烈的抑制作用。ASC 切割Bid 被認(rèn)為是 caspase-2 調(diào)控線粒體通透性的中間環(huán)節(jié)。ASC 還能通過(guò)活性氧的產(chǎn)生激活 JNK，在 ASC 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。ASC 引起 DNA 損傷，激活 caspase-2，進(jìn)而造成線粒體改變，而 JNK1 在此通路中的作用發(fā)生于線粒體上游。

得自海洋線蟲(chóng) cephalodiscus gilchristi 的天然藥物cephalostatin 是一種細(xì)胞凋亡的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，有可能應(yīng)用于對(duì)多種藥物耐藥的癌癥病例[27]。Cephalostatin具有獨(dú)特的細(xì)胞毒性，能選擇性地誘導(dǎo) Smac/DIABLO 進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 從線粒體中釋放。細(xì)胞凋亡過(guò)程中，caspase-9 被活化，而此過(guò)程不需凋亡復(fù)合體的參與。在此非經(jīng)典的 caspase-9激活過(guò)程中，還觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的 caspase-4 的參與，進(jìn)一步表明該藥物引起凋亡途徑的特殊性。另有研究發(fā)現(xiàn)，一種啟動(dòng)型 caspase —— caspase-2 在cephalostatin 的作用下，也可誘導(dǎo) Smac/DIABLO 的釋放。Cephalostatin 還能促進(jìn) PIDD （p53-induced protein with a DD），RAIDD（RIP-associated ICH-1/CED-3-homologous protein with death domain）與 caspase-2 形成一個(gè)凋亡復(fù)合物 PIDDosome[26]。此外，還發(fā)現(xiàn) cephalostatin 能通過(guò)高磷酸化滅活 Bcl-2，并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異的細(xì)胞凋亡途徑[28-30]。

2.2 Caspase-8 激活的外源性細(xì)胞凋亡通路

死亡配體與其相應(yīng)受體結(jié)合，活化的受體在膜上募集連接蛋白，并活化啟動(dòng)型 caspase —— caspase-8 和caspase-10。和內(nèi)源性通路一樣，各種細(xì)胞外刺激信號(hào)包括海洋藥物誘導(dǎo)的 JNK 活化也在外源性細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過(guò)程中發(fā)揮作用。

從地中海有囊動(dòng)物 aplidium albicans 提取的 aplidine水平就能誘導(dǎo)人類(lèi)白血病細(xì)胞系和原代培養(yǎng)的白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。以阻斷型抗 Fas 抗體抑制 Fas (CD95)/Fas 配體信號(hào)通路可部分地抑制 aplidine 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在轉(zhuǎn)染Fas cDNA 之后，對(duì) aplidine 表現(xiàn)為抗性的 L929 細(xì)胞發(fā)生凋亡。Aplidine 能誘導(dǎo)快速而持久的 JNK 活化，以抑制劑姜黃色素或 SP600125 預(yù)處理能阻斷其活性。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的激酶（ERK）和 p38 激酶通路不參與 aplidine 誘導(dǎo)的凋亡。Aplidine 對(duì) caspase-3 具有激活作用，在 caspase-3缺陷的 MCF7 乳腺癌細(xì)胞不能引起凋亡，進(jìn)一步證實(shí)caspase-3 的促凋亡活性。Aplidine 能刺激細(xì)胞色素 C 從線粒體中的早期釋放，迅速誘導(dǎo) Bid 的切割，而后者是連接Fas/Cd95 死亡受體與線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑的媒介。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，aplidine 作用于 Fas/Cd95 和線粒體介導(dǎo)的信號(hào)通路，是白血病細(xì)胞中一種強(qiáng)烈而快速的凋亡誘導(dǎo)劑，并且對(duì)癌細(xì)胞和激活的 T 細(xì)胞具有選擇性的作用[31-35]。早期的研究提示，aplidine 通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的合成與降低鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性發(fā)揮抑制增殖的效應(yīng)[35]。Aplidine 具有激活EGFR、Src、JNK 和 p38MAPK 的作用，并且能誘導(dǎo) AP1家族的 c-JUN、JUN B、JUN D、c-FOS、FRA-1 和 FOS B基因以及 NF-kappaB 的主要成分 p65/REL A，能同時(shí)增強(qiáng)AP-1 和 NF-kappaB 的活性，在 JNK 高活性的情況下，對(duì)增殖細(xì)胞產(chǎn)生高度的細(xì)胞毒作用[36]，目前已進(jìn)入 II 期臨床實(shí)驗(yàn)。

Irciniastatin A（ISA）[37]和 psymberin[38]均為隱翅蟲(chóng)素型的天然藥物，分別從海綿 irciniaramose 和 psammocinia sp.提取得到，分析表明兩者是同一化合物[39]。ISA 對(duì)人類(lèi)癌細(xì)胞系，具有極為強(qiáng)烈和選擇性的細(xì)胞毒性[37-38]，并對(duì)蛋白質(zhì)的合成具有強(qiáng)烈的抑制作用，誘導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，在此過(guò)程中伴有應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白激酶（SAPK）活化。這些激酶包括 JNK 和 p38，其活化過(guò)程緩慢而持久，在轉(zhuǎn)染 Bcl-x(L) 的細(xì)胞、ISA 誘導(dǎo) JNK 和 p38 的活化過(guò)程則明顯縮短[40]。

上述幾種能調(diào)控細(xì)胞凋亡的海洋藥物，均通過(guò)激活啟動(dòng)型 caspase 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這些藥物在發(fā)揮作用的過(guò)程中，有些誘導(dǎo)了死亡受體的表達(dá)，有些則未觀察到Fas/CD95 的改變，而是類(lèi)似于 IκB 持續(xù)表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡：caspase-8 被活化，線粒體膜通透性增加，促凋亡因子釋放到胞漿，但細(xì)胞表面死亡受體表達(dá)水平未見(jiàn)改變[41]。觀察結(jié)果提示，在對(duì)抗癌藥物的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步認(rèn)識(shí)的同時(shí)，對(duì) caspase-8 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程的認(rèn)識(shí)也有待深化。

3 結(jié)論

目前已發(fā)現(xiàn)多種海洋藥物具有抗腫瘤的活性，其中很多與臨床正在使用的抗癌藥并無(wú)交叉作用。相對(duì)于常規(guī)使用的抗癌藥，某些藥物還有獨(dú)特的作用機(jī)制，在抗癌治療方面顯然起到了補(bǔ)充作用。該領(lǐng)域的研究有待繼續(xù)深入，以期開(kāi)發(fā)出更多具有抗腫瘤活性的天然藥物。

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