壯藥解毒抗白顆粒毒理學(xué)研究△

鐘鳴周智余勝民吳超權(quán)覃君良游伯翔陳邦樹韋奇志

（1.廣西民族醫(yī)藥研究院,廣西 南寧 530001;2.廣西食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

壯藥解毒抗白顆粒是廣西壯民族民間驗方，由白花蛇舌草、半枝蓮、馬齒莧和龍葵等藥物組成。用于急、慢性白血病等惡性腫瘤的輔助治療。在前期開展提取工藝研究[1]及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的基礎(chǔ)上，本文觀察以受試藥物ig.給藥，小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)以及觀察連續(xù)重復(fù)給予受試藥物對大鼠產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴重程度、靶器官、恢復(fù)和發(fā)展情況等，確定無毒反應(yīng)劑量，為該藥的安全性評價提供實驗依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 實驗材料

1.1 受試藥物：解毒抗白顆粒，臨床擬用量為口服113g原藥材/日。受試藥物為解毒抗白顆粒浸膏，棕褐色半固體，每1g浸膏相當(dāng)于2.99g原藥材，相對密度1.2631(即1mL浸膏相當(dāng)于3.7767g原藥材)，生產(chǎn)日期2009年7月13日，廣西民族醫(yī)藥研究院提供。試驗時以純化水將受試樣品配成所需濃度的藥液供試，并使各組給藥體積相等。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)條件

1.2.1 KM小白鼠，SPF級，♀♂兼用，體重17～20g，廣西食品藥品檢驗所實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2003-0001。動物♀♂分籠群養(yǎng)于屏障環(huán)境，自動供水供飼，喂全價固體飼料。實驗室溫度22～25℃，相對濕度50～65%。

1.2.2 SD 大白鼠，SPF 級，♀鼠體重 188±13g，♂鼠體重 192±15g，廣西食品藥品檢驗所實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK桂2003-0001。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，每籠5～6只，自動供水供飼，固體全價飼料和滅菌生活用水喂養(yǎng)；實驗室溫度20～26℃，相對濕度45～75%，動物實驗環(huán)境許可證號SYXK桂2003-0002。

1.3 實驗試劑：總蛋白、白蛋白、總膽紅素、尿素、肌酐、總膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、磷酸肌酸激酶試劑盒，桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司產(chǎn)品。鉀、鈉、氯試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司產(chǎn)品。凝血酶原時間試劑盒，上海太陽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。血細胞分析儀用溶血劑、血細胞分析儀用稀釋液，桂林高新區(qū)寶利泰醫(yī)療電子有限公司產(chǎn)品。校準(zhǔn)血清(CAL2350)、質(zhì)控血清(HN1530)，RANDOX公司產(chǎn)品。電解質(zhì)分析儀用校準(zhǔn)液(漂移、斜率)，深圳市希萊恒醫(yī)用電子有限公司產(chǎn)品。純化水，廣西食品藥品檢驗所制備。

1.4 實驗儀器：7020全自動生化分析儀、Botest-3100全自動血液分析儀、GF-D800半自動生化分析儀、LG-PABER-1血小板聚集凝血因子分析儀、JA5003N電子天平、TD5A-WS臺式低速離心機、BI-2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 小鼠急性毒性試驗[2]：取解毒抗白顆粒浸膏200mL，于80℃水浴濃縮成含原藥材4.316g·mL-1作為1號受試藥液；按劑距1:0.8用純化水將1號藥液逐一稀釋得2號 (3.453g·mL-1)、3號(2.762g·mL-1)、4 號(2.210g·mL-1)、5 號(1.768g·mL-1)受試藥液，分別供5個組動物灌胃投藥，使各劑量組給藥體積相等。取上述小鼠50只(♀♂各半),隨機均分為5組，禁飼(供水)15h后分別灌胃給予5種濃度的受試藥液40mL·kg-1。觀察給藥后至第7天各鼠的反應(yīng)及死亡等情況。

2.2 大鼠長期毒性試驗[3]：取上述大鼠隨機分4組，每組22只(♀♂各半)，3 個組分別按原藥材 94.4g·kg-1、47.2g·kg-1、23.6g·kg-1的劑量給解毒抗白顆粒原生藥浸膏，對照組給純化水。每日灌胃給藥1次，各組給藥體積均為25mL/kg/次，連續(xù)91天。觀察給藥期間大鼠的一般表現(xiàn)及毒性反應(yīng)情況；每周稱量體重1次，并根據(jù)體重調(diào)整給藥量；每周測定各籠大鼠食量1次。分別于末次給藥次日、停藥2周后各組取部分大鼠(禁飼15～16h)腹腔注射戊巴比妥鈉40mg·kg-1麻醉，經(jīng)腹主動脈采血作血液學(xué)、血液生化學(xué)檢查；剖取部分臟器稱重，按每100g體重所含臟器重量換算成臟器重量指數(shù)；剖取主要臟器作肉眼及組織學(xué)檢查。將各給藥組測定值與對照組比較，作組間t檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 解毒抗白顆粒小鼠急性毒性試驗結(jié)果：給藥后大部分小鼠活動增加，部分小鼠給藥后即抽搐、死亡，大部分死亡發(fā)生在藥后30min內(nèi)，死亡動物無明顯性別差異；以上小鼠毒性反應(yīng)程度與劑量正相關(guān)。對死亡小鼠作解剖檢查，主要內(nèi)臟器官均未見明顯的肉眼形態(tài)學(xué)改變。未死亡小鼠于藥后8h逐步恢復(fù)正常。小鼠死亡情況及Bliss法計算LD50為原藥材96.473g·kg-1(95%可信限為 84.79～108.31g·kg-1)，LD5為原藥材 65.875g/kg，LD95為原藥材 141.28g·kg-1，具體結(jié)果見表 1。

表1 解毒抗白顆粒對小鼠ig.給藥急性毒性結(jié)果

3.2 解毒抗白顆粒大鼠長期毒性試驗結(jié)果

3.2.1 給藥91天及停藥觀察2周期間大鼠的一般情況：各給藥組動物的外觀體征、行為活動、食量、腺體分泌、呼吸、糞便等未見明顯異常。大劑量組有3只動物死亡。除大劑量組有體重增長緩慢現(xiàn)象外，各給藥組大鼠的體重增長值均與對照組相近。大劑量組大鼠的攝食量略少于對照組，其它給藥組大鼠的攝食量均與對照組接近。試驗結(jié)果表明，受試樣品在試驗劑量下對大鼠的一般狀況無明顯影響。

3.2.2 對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響：給藥91天后，大劑量組的LY、MCHC值高于對照組(P＜0.05、0.01)，大劑量組的HGB值低于對照組(P＜0.01)，大、中、小劑量組的 RET 值均高于對照組(P＜0.01)。停藥2周后，大、中劑量組的HGB值低于對照組(P＜0.05)，大劑量組的HCT低于對照組(P＜0.05)，大、中劑量組的RET值均高于對照組(P＜0.01)。見表 2。

試驗結(jié)果表明，受試樣品在試驗劑量下連續(xù)給藥91天，可出現(xiàn)RET明顯增高的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象與劑量正相關(guān)，但在停藥2周后有明顯恢復(fù)正常的趨勢；在94.4g·kg-1劑量下可致血液HGB輕度降低，停藥2周后也有恢復(fù)的趨勢；提示這些現(xiàn)象是可逆的。上述LY、HCT、MCHC的變化幅度小，無規(guī)律性，且在正常值范圍，認為系屬正常波動，不具明顯的毒理學(xué)意義。受試樣品在試驗劑量下對大鼠的其它血液學(xué)指標(biāo)均未見有明顯毒性意義的影響。

3.2.3 對大鼠血生化指標(biāo)的影響：給藥91天后，大劑量組的TBil和GLU略高于對照組(P＜0.05)，大劑量組的UREA和TG略低于對照組(P＜0.05、0.01)，大、中、小劑量組的 CK 均低于對照組(P＜0.01、0.05)。停藥 2 周后，這些指標(biāo)均恢復(fù)到正常范圍(P＞0.05)。見表3。

試驗結(jié)果表明，受試樣品在試驗劑量下連續(xù)給藥91天，可出現(xiàn)CK活性明顯降低的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象與劑量正相關(guān)，但在停藥2周后CK活性基本恢復(fù)至正常水平，提示這種現(xiàn)象是可逆的。上述T-Bil、GLU、UREA、TG的變化幅度小，或無規(guī)律性，或在正常值范圍，認為系屬正常波動，不具明顯的毒理學(xué)意義。受試樣品在試驗劑量下對大鼠的其它血液生化指標(biāo)均未見有明顯毒性意義的影響。

表2 解毒抗白顆粒長毒試驗血液學(xué)測定結(jié)果(±s)

表2 解毒抗白顆粒長毒試驗血液學(xué)測定結(jié)果(±s)

注：1、時間A為給藥91天后；大劑量組n=10，中劑量組n=12，小劑量組n=12，水對照組n=12；2、時間B為停藥2周后；大劑量組n=9，中劑量組n=10，小劑量組n=10，水對照組n=10。

項目 時間 大劑量組 中劑量組 小劑量組 對照組WBC(109/L)LY(109/L)MO(109/L)GR(109/L)RBC(1012/L)HGB(g/L)HCT(%)MCV(fL)MCH(Pg)MCHC(g/L)PLT(109/L)RET(%)PT(s)ABABABABABABABABABABABABAB 3.30±1.37 2.42±0.66 2.69±1.08*2.16±0.59 0.28±0.16 0.16±0.07 0.33±0.21 0.11±0.03 6.45±0.49 6.41±0.37 121.2±4.61*123.3±3.00*29.1±1.39 28.2±1.35*45.2±2.37 44.1±1.30 18.8±0.95 19.2±0.81 416.5±6.70*437.7±14.8 416.2±82.4 326.3±22.5 16.3±2.69*5.50±1.09*11.2±1.22 13.7±0.94 2.53±1.14 2.17±0.81 2.07±0.93 1.92±0.72 0.20±0.10 0.12±0.08 0.27±0.14 0.13±0.08 6.54±0.43 6.37±0.55 125.3±5.80 123.0±6.65*29.9±1.63 28.6±2.37 46.0±1.85 45.0±1.44 19.2±0.71 19.3±0.84 418.1±9.63 431.0±15.0 383.2±58.1 323.9±49.3 9.63±1.57*4.55±0.76*12.0±1.20 13.6±1.13 2.74±0.89 2.51±1.44 2.28±0.80 2.13±1.15 0.22±0.07 0.20±0.18 0.25±0.09 0.18±0.13 6.61±0.53 6.54±0.54 124.6±5.16 125.5±5.40 29.6±1.52 28.8±2.00 45.1±2.24 44.2±1.69 18.9±1.04 19.2±0.85 420.4±9.75 436.0±15.0 422.0±51.2 330.6±47.4 6.04±1.47*3.70±1.21 10.7±1.77 13.5±0.70 2.23±1.14 2.64±1.20 1.77±0.89 2.26±0.93 0.19±0.12 0.22±0.16 0.27±0.19 0.16±0.13 6.74±0.39 6.80±0.59 127.7±3.34 130.0±6.93 30.0±1.05 30.1±2.26 44.7±1.62 44.5±2.72 18.9±0.77 19.1±0.97 424.8±6.67 432.1±16.7 388.8±60.7 346.9±64.6 3.50±1.02 3.25±1.03 11.7±0.79 13.4±0.50

3.2.4 主要臟器解剖檢查結(jié)果：給藥91天后及停藥2周后，剖取各組大鼠的心、肺、肝、脾、腎、腦、胃、腸、胸腺、膀胱、子宮、卵巢、睪丸、附睪等臟器作肉眼觀察，均未見明顯的形態(tài)學(xué)改變。

給藥91天剖取各組大鼠的主要臟器心、肺、肝、脾、腎、腦、胸腺、腎上腺、子宮、睪丸、附睪測定重量指數(shù)，大、中、小劑量組的肝、腎臟器指數(shù)均大于對照組(P＜0.01、0.05)，但停藥2周后這些臟器指數(shù)均與對照組相近(P＞0.05)。試驗結(jié)果表明，受試樣品在試驗劑量下給藥91天可致大鼠的肝、腎臟器指數(shù)增大，但停藥2周后肝、腎臟器指數(shù)均恢復(fù)至對照組的水平，提示這些改變是可逆的。受試樣品在試驗劑量下對大鼠的其它主要臟器指數(shù)均無明顯的大體形態(tài)學(xué)影響，具體結(jié)果見表4。

3.2.5 對大鼠的病理組織學(xué)檢查：給藥91天后及停藥2周后分別剖取大劑量組、對照組大鼠的心、肺、肝、脾、腎、大腦、腦垂體、脊髓、胸骨、胃、小腸、大腸、腎上腺、胸腺、腸系膜淋巴結(jié)、膀胱、子宮、卵巢、睪丸、附睪作組織學(xué)檢查。結(jié)果大劑量組1例心多灶狀間質(zhì)纖維化，對照組1例心灶狀間質(zhì)炎；大劑量組2例肝細胞灶性輕度脂肪變性、2例肝細胞輕度水變性，對照組3例肝細胞灶性輕度脂肪變性；大劑量組1例腎腫大、彌漫腎小管水變性、蛋白管型形成和灶狀壞死。

停藥2周后，大劑量組1例肝細胞灶性輕度脂肪變性、1例肝細胞輕度水變性，對照組4例肝細胞灶性輕度或中度脂肪變性；大劑量組1例脾巨噬細胞增生吞噬大量含鐵血黃素；對照組1例睪丸發(fā)育不良，曲細精管內(nèi)精原細胞缺失無精子，附睪內(nèi)未見精子。

表3 解毒抗白顆粒長毒試驗血液生化學(xué)測定結(jié)果(±s)

表3 解毒抗白顆粒長毒試驗血液生化學(xué)測定結(jié)果(±s)

項目 時間 大劑量組 中劑量組 小劑量組 對照組TP(g/L)ALB(g/L)T-Bil(umol/L)ALT(U/L)AST(U/L)ALP(U/L)CK(U/L)GLU(mmol/L)UREA(mmol/L)CREA(umol/L)T-Cho(umol/L)TG(mmol/L)K(mmol/L)Na(mmol/L)Cl(mmol/L)ABABABABABABABABABABABABABABAB 60.1±4.41 62.2±4.64 34.0±3.48 35.4±4.06 6.24±1.34*5.81±1.35 46.5±33.6 34.2±9.32 159.0±29.1 156.0±24.8 58.2±25.9 48.6±21.5 379±209*1045±287 5.15±0.68*5.12±0.87 6.92±0.74*6.91±0.84 90.0±9.03 109.0±12.8 1.60±0.56 2.03±0.48 0.82±0.24*1.46±0.67 4.91±3.10 3.98±0.23 146.3±28.3 140.2±2.06 105.0±4.56 106.7±1.71 60.9±4.27 60.9±4.82 35.0±3.32 34.1±6.23 5.33±0.94 6.00±1.47 31.5±6.02 35.4±9.34 137.5±33.8 150.8±48.1 52.3±14.7 49.9±33.3 558±117*1020±702 4.93±1.03 4.94±0.96 7.14±1.01 6.60±1.28 90.7±9.50 107.0±17.8 1.90±0.43 1.75±0.48 1.18±0.46 1.48±0.96 4.43±1.33 4.11±0.31 142.6±6.72 140.7±2.04 106.6±4.89 107.5±2.17 63.1±5.87 62.9±6.43 35.7±5.48 36.2±4.04 6.08±2.02 5.83±1.58 31.2±5.32 45.1±48.3 156.7±59.6 165.7±62.3 42.7±21.4 38.1±21.7 725±235*852±347 5.34±1.65 4.46±0.73 7.30±1.52 6.51±0.47 95.6±8.77 112.2±9.42 1.76±0.57 2.15±1.01 1.82±0.95 1.49±0.60 4.06±0.45 4.13±0.29 143.0±5.50 141.3±1.57 105.1±3.96 107.9±2.12 61.4±4.75 60.6±6.06 35.4±3.70 35.7±4.81 5.19±0.96 6.70±1.87 33.1±5.88 35.3±8.18 158.2±57.6 136.3±26.2 46.2±19.8 38.8±18.5 1116±563 1223±945 4.35±0.76 4.99±0.69 7.51±0.52 6.50±0.98 93.1±6.19 101.3±19.0 1.94±0.43 1.74±0.40 1.53±0.58 1.18±0.38 4.20±0.52 3.93±0.24 144.8±3.55 141.5±1.28 107.1±4.15 108.5±1.95

上述大劑量組的心臟、肝臟、腎臟、脾臟的組織學(xué)病變，或與對照組間無明顯差異，或?qū)俅笫蟮某Ｒ娮园l(fā)病，或為偶發(fā)病變，均不能確認與受試樣品相關(guān)，故基本認為不具毒理學(xué)意義。表明受試樣品在試驗劑量下對大鼠的主要臟器均無明顯的組織學(xué)影響。

4 討論

急性毒性試驗結(jié)果表明，以解毒抗白顆粒浸膏給小鼠灌胃投藥，LD50為原藥材 96.473g·kg-1(95%可信限 84.79～108.31g·kg-1)，相當(dāng)于臨床擬用日劑量的51倍；LD95為原藥材141.28g·kg-1，相當(dāng)于臨床擬用日劑量的75倍；LD5為原藥材65.875g·kg-1，相當(dāng)于臨床擬用日劑量的35倍。提示解毒抗白顆粒按臨床日劑量口服可能是安全的。

長期毒性試驗結(jié)果表明，按原藥材 94.4g·kg-1、47.2g·kg-1、23.6g·kg-1的劑量(臨床擬用日劑量的 50倍、25倍、12.5倍)分別給大鼠連續(xù)灌服解毒抗白顆粒原生藥浸膏91天，可出現(xiàn)血液RET明顯增高、血清CK活性明顯降低、肝和腎臟器指數(shù)增大的現(xiàn)象；在94.4g·kg-1劑量組還出現(xiàn)體重增長緩慢、攝食量減少、血液HGB輕度降低；但這些改變均為可逆的，在停藥2周后可恢復(fù)正?；蛴谢謴?fù)正常的趨勢。未觀察到其它明顯的慢性毒性反應(yīng)和延緩毒性反應(yīng)。

表4 解毒抗白顆粒長毒試驗臟器指數(shù)測定結(jié)果(g/100g;)

網(wǎng)織紅細胞增高而不伴隨明顯的貧血現(xiàn)象，可能不具毒理學(xué)意義，僅提示骨髓造血功能增強；磷酸肌酸激酶活性降低，一般認為無毒理學(xué)意義；肝腎臟器指數(shù)增大而無明顯肝腎功能損害的生化指標(biāo)變化，可能是藥物代謝過程加重肝臟和腎臟負擔(dān)的一種正常代償反應(yīng)。

此外，由于受試樣品性狀的限制，灌胃給藥的體積須達到25mL·kg-1才滿足上述劑量的要求。灌胃量大也可能是造成動物攝食量降低和體重增長緩慢的原因之一，一些觀察指標(biāo)的變化是否也與此有關(guān)尚無法確定。

試驗結(jié)果提示，解毒抗白顆粒樣品按臨床擬定劑量、途徑、療程在臨床上應(yīng)用可能是安全的。

[1]王志萍,鐘鳴,譚珍瑗,等.壯藥解毒抗白顆粒提取工藝研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(5):28～30.

[2]SFDA.藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則(2005年):中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則.

[3]SFDA.藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則(2005年):中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則.