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    生物素親和素系統(tǒng)在ECP的實(shí)驗(yàn)效能

    2012-11-28 01:32:58趙俊芳王學(xué)謙李桂珍
    天津醫(yī)藥 2012年3期
    關(guān)鍵詞:生物素包被檢測(cè)法

    趙俊芳 王學(xué)謙 李桂珍

    嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(eosinophilia cationic protein,ECP)是一種相對(duì)分子質(zhì)量為21 ku的堿性蛋白,存在于嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil,EOS)顆粒的基質(zhì)部分。其作為EOS的活性標(biāo)記,已被廣泛應(yīng)用于變態(tài)反應(yīng)疾病的診斷、治療和療效判定中。生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system,BAS)是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué),并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于生物素、親和素均可與蛋白質(zhì)、核酸、多糖和酶等生物活性物質(zhì)結(jié)合,同時(shí)還能與固相材料結(jié)合,減少反應(yīng)中的空間位阻,故其在ELISA中得到廣泛應(yīng)用。本研究將BAS應(yīng)用于ECP的檢測(cè),評(píng)估其對(duì)實(shí)驗(yàn)效能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與儀器 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)購(gòu)自美國(guó)GE公司,二甲基酰胺(DMF)、N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHS-d-生物素)、親和素(13 g/L)購(gòu)自Sigma公司;ECP抗原(Ag)0.1 g/L、抗ECP單克隆抗體(mAb)0.25 g/L購(gòu)自芬蘭Hytest公司;抗ECP多克隆抗體(pAb)購(gòu)自沃克生物科技公司,由免疫動(dòng)物制備;ECP雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(美國(guó)ADL公司),96孔酶標(biāo)反應(yīng)板(美國(guó)Costar公司),酶標(biāo)分析儀(DNM-9602,北京普朗新技術(shù)有限公司);洗板機(jī)(EL×50,美國(guó) BioTek Instruments公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 HRP標(biāo)記抗ECPpAb 純化的抗ECPpAb經(jīng)改良過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記HRP,經(jīng)方陣實(shí)驗(yàn)確定其應(yīng)用濃度為1∶8 000,-86℃保存,常規(guī)應(yīng)用于-20℃保存[1]。

    1.2.2 抗ECP mAb純化 用ECP親和層析柱純化抗ECP mAb[2],經(jīng)非變性SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)其在83~175 kb之間有清晰條帶,無(wú)其他雜帶,在還原性SDS-PAGE電泳中,有2條清晰條帶。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其抗體濃度為0.96 g/L。

    1.2.3 抗-ECPmAb的生物素化 取1 mL純化抗ECPmAb,經(jīng)0.1 mol/L碳酸鹽(pH 9.5)溶液透析后得到抗體600μL,其在280 nm處的吸光度(A280)為2.512。在抗體中加入3μL 20 g/L DMF溶解的生物素溶液,室溫反應(yīng)1 h。將該液體濾過(guò)經(jīng)pH7.4 PBS/proclin溶液平衡的Sephadex G25(柱長(zhǎng)12 cm,內(nèi)徑1.1 cm,流速800μL/min),收集第1個(gè)洗脫峰,共得液體2 mL,該液體為生物素化的抗ECPmAb,4℃保存[3]。繼續(xù)用pH7.4 PBS/proclin溶液洗柱,出現(xiàn)第2個(gè)洗脫峰(為游離生物素),洗至基線后,用儲(chǔ)存液繼續(xù)洗脫凝膠柱。

    1.2.4 生物素化牛血清白蛋白(BSA) 將0.3 g BSA溶解于30 mL pH 9.5的碳酸鹽(0.1 mol/L)溶液中,充分?jǐn)嚢?0 min。將0.1 g NHS-d-生物素溶解于3 mLDMF中,充分?jǐn)嚢枞芙?。?種溶液混合,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h,過(guò)0.22μm濾膜。將所得液體濾過(guò)Sephadex G25柱(柱體積為250 mL,流速3 mL/min)。接收第1個(gè)洗脫峰,所得液體為生物素化的BSA(biotinylation of BSA,BBC),體積為64 mL,終濃度約為5 g/L。

    1.2.5 建立直接包被抗體的檢測(cè)法 將1∶500稀釋的抗ECPmAb 150μL室溫過(guò)夜包被,洗滌后加入200μL封閉液,37℃封閉2 h,洗滌,加樣品稀釋液稀釋的ECP標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)血清,50μL/孔,再加入酶稀釋液1∶8 000稀釋的酶標(biāo)抗人ECPpAb100μL/孔,37℃水浴1 h。洗滌后加入底物A、B,避光室溫反應(yīng)15 min后加入終止液。30 min內(nèi)以450 nm為檢測(cè)波長(zhǎng),630 nm為參考波長(zhǎng),讀取吸光度。

    1.2.6 建立先包被生物素的檢測(cè)法 1∶1 500稀釋BBC 150 μL包被過(guò)夜,洗滌后再包被1次。洗滌后加入150μL 375倍稀釋的親和素,室溫2 h,洗滌,加入封閉液200μL,37℃烤箱放置2 h。洗板3次后,每孔加入150μL稀釋(1∶1 200)的生物素化單抗,室溫放置2 h。檢測(cè)過(guò)程同1.2.5。

    1.2.7 建立先包被親和素的檢測(cè)法 用1∶300稀釋的親和素150μL包板,室溫過(guò)夜,洗滌后加入封閉液200μL,37℃烤箱放置2 h。洗滌,每孔加入150μL稀釋(1∶1 200)的生物素化單抗,室溫放置2 h。檢測(cè)過(guò)程同1.2.5。

    1.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立 將ECP抗原稀釋為0、2.5、5、10、20、50、100、200、500和1 000 μg/L的濃度,作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.9 試驗(yàn)效能評(píng)價(jià) (1)靈敏度:對(duì)濃度為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低值進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)試,其平均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差為檢測(cè)方法的靈敏度。(2)不準(zhǔn)確度:檢測(cè)高值(38μg/L),低值(8μg/L)標(biāo)本,每個(gè)測(cè)試做2次,取平均值,用相對(duì)偏差(Bias%)來(lái)表示測(cè)定結(jié)果的不準(zhǔn)確度。(3)重復(fù)性:對(duì)高值(38μg/L),低值(8 μg/L)標(biāo)本重復(fù)測(cè)定10次,計(jì)算其批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)。(4)穩(wěn)定性:將3種方法的試劑盒放置37℃烘箱于3、4、6、12 d取出,與4℃放置試劑盒測(cè)定同一批標(biāo)本,比較其穩(wěn)定性。

    1.2.10 臨床血清標(biāo)本的檢測(cè) 選取2009年1月—2010年5月我院收治的過(guò)敏性皮膚病患者380例(患者組)和正常體檢者56例(對(duì)照組),均靜脈取血3 mL,室溫下放置60 min后,1 000 r/min離心15 min,血清放-20℃冰箱保存。用本研究制備的3種檢測(cè)試劑盒以及美國(guó)ADL雙抗夾心檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)ECP水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,多組間比較采用方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 3種方法的線性范圍比較 3種方法的線性都較好,先包被生物素的檢測(cè)法和先包被親和素的檢測(cè)法的線性范圍較寬,見(jiàn)表1。

    Table1 Comparison of linear rangebetween threemethods表1 3種方法線性范圍比較

    2.2 3種方法的變異度、靈敏度和不準(zhǔn)確度比較 3種方法的變異系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.16,P>0.05);重復(fù)性都較好,靈敏度、不準(zhǔn)確度相近,見(jiàn)表2。

    Table2 Comparison of variation,sensibility and inaccuracy between three methods表2 3種方法的變異度、靈敏度和不準(zhǔn)確度比較

    2.3 穩(wěn)定性比較 先包被親和素的檢測(cè)法最為穩(wěn)定,試劑盒在37℃條件下放置12 d,與4℃放置試劑盒對(duì)比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.811,P>0.05);直接包被抗體的檢測(cè)法次之,試劑盒在37℃放置12 d,與4℃放置試劑盒對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.98,P<0.05),先包被生物素的檢測(cè)法最不穩(wěn)定,試劑盒在37℃放置4、6和12 d,與4℃放置試劑盒對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為2.76、3.59、8.21,均P<0.05),見(jiàn)表3。

    Table 3 Resultsof ELISA stability between threemethods表3 3種方法的試劑盒穩(wěn)定性結(jié)果 (μg/L,±s)

    Table 3 Resultsof ELISA stability between threemethods表3 3種方法的試劑盒穩(wěn)定性結(jié)果 (μg/L,±s)

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    2.4 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 4種方法之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表4。

    Table4 Comparison of levelsof eosinophilia cationic protein usingfour methodsin patient group and control group表4 4種方法檢測(cè)患者組與對(duì)照組ECP水平比較(μg/L,±s)

    Table4 Comparison of levelsof eosinophilia cationic protein usingfour methodsin patient group and control group表4 4種方法檢測(cè)患者組與對(duì)照組ECP水平比較(μg/L,±s)

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    3 討論

    近年來(lái)研究表明,血ECP水平與過(guò)敏性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),ECP是疾病診斷、病情監(jiān)測(cè)的較好指標(biāo)[4]。目前用于檢測(cè)ECP的商品試劑盒均為國(guó)外進(jìn)口,具有操作簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)點(diǎn),但價(jià)格都比較昂貴,故研制性價(jià)比高的國(guó)產(chǎn)ECP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒具有重要意義。

    生物素親和素技術(shù)是近幾年來(lái)發(fā)展很迅速的一門生物學(xué)技術(shù)。其原理基于生物素與親和素的以下特征:(1)二者具有高度特異的親和性。(2)橋聯(lián)作用。(3)多級(jí)放大作用。BAS在酶促反應(yīng)中的作用是通過(guò)生物素親和素將免疫復(fù)合物與酶連接起來(lái),形成放大酶免法。由于生物素親和素技術(shù)的多級(jí)放大作用,該法較免疫擴(kuò)散法和ELISA法具有更高的靈敏度。生物素親和素也可預(yù)包被在酶標(biāo)板孔內(nèi),然后再將生物素化Ab(或Ag)包被于孔內(nèi),從而解決了一些Ab(或Ag)不易包被的難題,也提高了檢測(cè)靈敏度。汪進(jìn)等[5]在檢測(cè)HBsAg的ELISA法中,采用鏈霉親合素預(yù)包被和Ab直接包被的酶標(biāo)板進(jìn)行比較,前者靈敏度可達(dá)0.15μg/L,后者為2 μg/L,而且前者在37℃下至少可保存3周。

    本研究中,筆者先將生物素化BSA與酶標(biāo)板結(jié)合,然后加入親和素,再加入生物素化的抗ECP mAb,這樣可大大提高抗體的結(jié)合量,提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度,增加線性范圍,同時(shí)可以節(jié)省一半以上的抗體,因?yàn)檫@種包被法不僅可增加固相載體上的抗體包被量,而且使其結(jié)合位點(diǎn)充分暴露,有利于免疫反應(yīng)的有效進(jìn)行[6]。先包被親和素,再加入生物素化的抗ECPpAb,也可增加線性范圍,且在本研究中,該法的穩(wěn)定性是最好的。本研究中,BBC包被后的試劑盒穩(wěn)定性稍差,可能是因?yàn)樽约褐苽涞腂BC不夠穩(wěn)定。就操作煩瑣程度而言,生物素包被法最為煩瑣,抗體包被法最簡(jiǎn)單。但是先包被生物素或親和素,封閉后再包被抗體,抗體包被時(shí)間只需2 h,且不需要再封閉,這在實(shí)際的檢測(cè)試劑盒制備中可以節(jié)省時(shí)間。

    本研究通過(guò)抗ECPmAb的純化、生物素化及抗ECPpAb的酶標(biāo)、多種實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化,制備了較為良好的ECP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。同時(shí),通過(guò)對(duì)3種檢測(cè)方法的比較,發(fā)現(xiàn)生物素親和素系統(tǒng)可提高實(shí)驗(yàn)的敏感度,節(jié)約抗體包被時(shí)間,并可節(jié)省包被抗體的用量,為ELISA試濟(jì)盒的制備提供又一思路。

    [1]沈關(guān)心.現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)[M].第2版.武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,2002:1511-152.

    [2]舒曉宏,李傳剛,張海濤,等.抗核糖酸酶抵制因子抗體的制備[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2004,20(5):572-574.

    [3]Mao SY.Biotinylation of antibodies[J].Methods Mol Biol,1999,115:39-41.

    [4]Kato M,Yamada Y,Maruyama K,etal.Serum eosinophil cationic protein and 27 cytokines/chemokines in acuteexacerbation of child?hood asthma[J].Int Arch Allergy Immunol,2010,152(Suppl 1):62-66.

    [5]汪進(jìn),羅偉.鏈霉親和素-生物素-ELISA方法的建立及其在HB?SAg測(cè)定中的應(yīng)用[J].上海檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,1998,13(4):213-214.

    [6]Chiu ML,Tseng TT,Monbouquette HG.A convenient homogeneous enzyme immunoassay for estradiol detection[J].Biotechnol Appl Biochem,2011,58(1):75-82.

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