2種消旋卡多曲制劑的人體生物等效性研究

栗 艷，周 倫，楊 靜，賈艷艷，宋 薇，馮智軍，鹿成韜，陳敏純，文愛東

（第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安 710032）

2種消旋卡多曲制劑的人體生物等效性研究

栗 艷＊，周 倫，楊 靜，賈艷艷，宋 薇，馮智軍，鹿成韜，陳敏純，文愛東#

（第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安 710032）

目的：研究消旋卡多曲散劑與消旋卡多曲顆粒的生物等效性。方法：20名健康男性志愿者隨機交叉單劑量口服消旋卡多曲散劑（受試制劑）或消旋卡多曲顆粒（參比制劑）200 mg后，采用液-質(zhì)聯(lián)用法測定血藥濃度，以DAS2.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)，并評價其生物等效性。結(jié)果：受試者單劑量口服200 mg消旋卡多曲受試制劑或參比制劑后，藥動學(xué)參數(shù)分別為：cmax（286.54±66.14）、（283.73±65.49）ng·mL－1，tmax（1.78±0.48）、（1.68±0.79）h，t1/2（4.02±1.26）、（4.00±1.11）h，AUC0～24h（1 353±431）、（1 293±320）ng·h·mL－1。經(jīng)方差分析、雙單側(cè)t檢驗及1－2α置信區(qū)間法統(tǒng)計分析，各藥動學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。受試制劑中消旋卡多曲的cmax、AUC0～24h、AUC0～∞的90%置信區(qū)間分別為92.2%～111.1%、98.1%～107.7%、98.6%～108.3%。結(jié)論：消旋卡多曲散劑與消旋卡多曲顆粒在人體內(nèi)生物等效。

消旋卡多曲；液-質(zhì)聯(lián)用；生物等效性；藥動學(xué)

消旋卡多曲在體內(nèi)被迅速水解成活性代謝產(chǎn)物Thiorphan（TP）[1]，該活性產(chǎn)物是腦啡肽酶的選擇性抑制劑，從而保護內(nèi)源性腦啡肽免受降解，增強其生理活性并產(chǎn)生抗分泌作用。臨床上消旋卡多曲連同口服補液一起，用于嬰兒急性腹瀉的對癥治療[2]。本試驗旨在通過液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法測定人血漿中消旋卡多曲的濃度，評價Laboratoire Bioprojet Pharma研制的消旋卡多曲散劑在健康受試者的藥動學(xué)特征及其與四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的消旋卡多曲顆粒是否等效，為臨床治療的有效性和安全性提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200液相色譜儀，含真空脫氣機、二元泵、自動進樣器、柱溫箱（美國Agilent公司）；6410三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；MassHunter工作站（美國Agilent公司）；TDL80-2B低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A渦旋混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TGL-16C高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電子天平（瑞士Sartorius公司）。

1.2 試藥

受試制劑：消旋卡多曲散劑（法國Laboratoire Bioprojet Pharma公司研制，委托北京信成博達科技有限公司，作生物等效性研究，規(guī)格：10 mg，批號：SXN137）；參比制劑：消旋卡多曲顆粒（杜拉寶，四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：10 mg，批號：080601）；消旋卡多曲對照品（Laboratoire Bioprojet Pharma，純度：99.06%，批號：DD2102.053）；TP對照品（法國Laboratorie Bioprojet Pharma公司，純度：99.06%，批號：DD2102.053）；內(nèi)標(biāo)：洛索洛芬鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：100.0%，批號：100638-200401）；甲醇為色譜純，甲酸、乙酸乙酯及L-半胱氨酸均為分析純；所有試驗用水均為雙重蒸餾水；空白血漿由第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

2 方法[3]與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil（150 mm×2.1 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%甲醇水溶液（75∶25）；流速：0.25 mL·min－1；進樣量：2μL；柱溫：35℃。

電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式進行監(jiān)測：TP：m/z 252.1→218.1，碰撞能量：5 eV；內(nèi)標(biāo)洛索洛芬鈉：m/z 245.1→83.0，碰撞能量：10 eV；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；裂解電壓：－70 V；駐留時間：200 ms；霧化氣溫度：350℃；霧化氣流速：10.5 L·min－1；霧化氣壓力：50 psi。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.2.1 TP標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取TP對照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇使之溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1 g·L－1的TP貯備液。精密量取TP貯備液1 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得100 mg·L－1的TP甲醇溶液。依次稀釋，配制成濃度為10.0、1.00 mg·L－1及100μg·L－1的TP甲醇溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取洛索洛芬鈉對照品10.0 mg，置于濃度為100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得100 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)貯備液。取一定量貯備液稀釋，配制成濃度為2 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血漿樣品的處理

取含藥血漿1 mL（已加入10 g·mL－1L-半胱氨酸水溶液100μL），置于10 mL的尖底玻璃離心管中，加入2 mg·mL－1內(nèi)標(biāo)溶液40μL及10%冰醋酸水溶液50μL，渦旋30 s；加入乙酸乙酯5 mL，渦旋振蕩3 min，4 000 r·min－1離心10 min，取有機層置于另一離心管中，加入10 g·mL－1L-半胱氨酸水溶液50μL，混勻；于30℃水浴中以氮氣流吹干，殘渣以流動相200μL溶解后于16 000 r·min－1離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動進樣器樣品管中，吸取2μL進樣分析。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及定量下限考察：取離心管數(shù)支，分別精密加入不同量的TP標(biāo)準(zhǔn)溶液，吹干后加入空白血漿1 mL，旋渦30 s混勻，配制成相當(dāng)于血漿TP質(zhì)量濃度為3.144、10.48、31.44、104.8、209.6、419.2、1 048 ng·mL－1的含藥血漿，按“2.3”項下方法操作，記錄色譜圖。以待測物濃度（c）為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積平均比值（f）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進行回歸計算，得到的直線回歸方程即為f＝0.009 346+0.009 168×c（r＝0.999 0）。結(jié)果表明，TP在血藥濃度3.144～1 048 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按上述條件測得TP在血漿中的定量下限為3.144 ng·mL－1。

2.4.2 專屬性：在本試驗所采用的色譜及質(zhì)譜條件下，TP的保留時間在1.4 min左右，內(nèi)標(biāo)的保留時間在1.7 min左右。TP和內(nèi)標(biāo)峰形良好，且空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾TP和內(nèi)標(biāo)的測定（見圖1）。結(jié)果表明本方法具有較高的選擇性，能準(zhǔn)確測定血漿中TP的濃度，靈敏度較高。

2.4.3 精密度及準(zhǔn)確度考察：取離心管數(shù)支，精密加入不同量的TP標(biāo)準(zhǔn)溶液，吹干后加入空白血漿1 mL，渦旋30 s混勻，配制成低、中、高（5.24、52.4、524 ng·mL－1）3種濃度的TP標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，每個濃度各做5份樣品，按“2.3”項下方法操作。依上述方法，連續(xù)3 d，并隨行一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，共3批，記錄色譜圖。計算TP峰面積（As）和內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）的比值f，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得樣品的實測濃度，考察日內(nèi)和日間精密度。將f代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算所得濃度和加入濃度的比值即為準(zhǔn)確度（方法回收率），結(jié)果詳見表1。

圖1 典型圖譜A.空白血漿；B.TP最低定量限；C.空白血漿+TP標(biāo)準(zhǔn)溶液+內(nèi)標(biāo)溶液；D.受試者口服消旋卡多曲后的血漿樣品；1.TP；2.洛索洛芬鈉Fig 1 Typical chromatogramsA.blank plasma；B.the LLOQ of TP；C.blank plasma spiked with TP and IS；D.plasma sample after oral dose of racecadotril；1.TP；2.loxoprofen sodium

表1 精密度及回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（n＝5）

2.4.4 提取回收率試驗：取按“2.4.3”項下方法制備的低、中、高（5.24、52.4、524 ng·mL－1）3種濃度的TP標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，每個濃度進行5樣本分析。以提取后測得的濃度與未經(jīng)提取直接測得的濃度之比，考察樣品的提取回收率。結(jié)果表明，TP在低、中、高3種濃度下樣品的提取回收率分別為（68.13±2.89）%、（75.27±3.70）%和（72.91±2.35）%。

2.4.5 樣品穩(wěn)定性考察：本試驗考察了TP血漿室溫24 h穩(wěn)定性，反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性、長期（30 d）凍存穩(wěn)定性及預(yù)處理后6 h的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，TP血漿在上述條件下測定的RSD均＜10%，表明TP血漿穩(wěn)定性良好。

2.5 受試者的選擇

20名男性健康受試者，體重58.0～67.0 kg，年齡30～39歲，經(jīng)醫(yī)療史、心電圖、血壓、血尿常規(guī)及肝腎功能檢查，確定為健康狀況良好。受試者在研究前7周內(nèi)未服用其他藥物。在被告知所有與藥物有關(guān)不良反應(yīng)后，各受試者簽署知情同意書；如在試驗期間出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)或疾病需要接受治療或要求退出試驗者，可終止試驗。

2.6 試驗方案

采用標(biāo)準(zhǔn)二階段交叉設(shè)計（Two-period crossover design）自身對照試驗方法，將20例受試者隨機分為A、R組，試驗第1階段A組受試者單劑量口服受試制劑消旋卡多曲散劑200 mg，R組單劑量口服參比制劑消旋卡多曲顆粒200 mg。經(jīng)1周清洗期后，2組交換服藥品種進行第2階段試驗。試驗過程中有醫(yī)療監(jiān)護及急救條件，試驗組成員有臨床主治醫(yī)師、護師及藥師參加。試驗期間禁止劇烈活動，禁止吸煙、飲酒或含藥物、酒精的飲料等。每次試驗前一天19：00后即禁食，早晨空腹給藥，用250 mL溫開水沖服，服藥2 h后方可再飲水，服藥后4 h進統(tǒng)一食譜的標(biāo)準(zhǔn)餐。服藥前0 h及服藥后20、30、40 min及1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、18.0、24.0 h時，由靜脈采血5 mL，置肝素化離心試管中（所有采血管在采血前加入L-半胱氨酸150μL作為抗氧化劑[3]），－20℃保存待測。本試驗方案已通過第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

對2種制劑的AUC、cmax、tmax進行方差分析、雙單側(cè)t檢驗，以1－2α置信區(qū)間法進行統(tǒng)計分析，判斷生物等效性。

2.8 藥-時曲線

20名受試者單劑量口服受試制劑或參比制劑200 mg后，平均藥-時曲線見圖2。

圖2 20名受試者單劑量口服受試制劑或參比制劑200 mg后的平均藥-時曲線Fig 2 Mean concentration-time curves of racecadotril in 20 healthy volunteers after a single oral administration of 200 mg test preparation or referencepreparation

2.9 藥動學(xué)參數(shù)及生物利用度

利用藥動學(xué)軟件DAS2.1.1，計算主要藥動學(xué)參數(shù)和生物等效性。cmax、tmax以實測值計算，AUC按梯形面積法計算。有關(guān)藥動學(xué)參數(shù)見表2。

表2 20名受試者單劑量口服受試制劑或參比制劑200 mg后的主要藥動學(xué)參數(shù)Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of racecadotril in 20 healthy volunteers after a single oral administration of 200 mg test preparation and referencepreparation

2.10 生物等效性評價

以四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的消旋卡多曲顆粒為參比制劑，估算法國Laboratoire Bioprojet Pharma公司研制的消旋卡多曲散劑相對生物利用度為（103.4±11.8）%。將受試制劑與參比制劑的消旋卡多曲藥動學(xué)參數(shù)cmax、AUC0～24h、AUC0～∞經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，進行方差分析，并采用雙向單側(cè)t檢驗和1－2α置信區(qū)間法進行生物等效性評價，結(jié)果表明，消旋卡多曲的cmax、AUC0～24h、AUC0～∞在兩制劑間均無顯著性差異，均拒絕生物不等效假設(shè)。受試制劑的cmax、AUC0～24h、AUC0～∞的90%置信區(qū)間分別為92.2%～111.1%、98.1%～107.7%、98.6%～108.3%；tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗無顯著性差異（P＞0.05）。根據(jù)以上結(jié)果判定受試制劑與參比制劑生物等效。

3 討論

本試驗所建立的測定消旋卡多曲在人體內(nèi)血藥濃度的方法[4～6]，操作簡便、快速、回收率高、方法靈敏、專屬性強、樣品分析時間短。因消旋卡多曲代謝物TP含有巰基，易被氧化，所以加入L-半胱氨酸保持樣品穩(wěn)定[7]。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾，完全可滿足消旋卡多曲血藥濃度測定及生物等效性研究的要求。

藥動學(xué)參數(shù)顯示，法國Laboratoire Bioprojet Pharma公司研制的消旋卡多曲散劑與四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的消旋卡多曲顆粒在健康人體內(nèi)的吸收、分布、消除較為接近。本試驗為消旋卡多曲散劑臨床用藥的安全性和有效性提供了依據(jù)。

試驗期間，受試者的依從性好，未發(fā)現(xiàn)違反試驗方案中與受試者相關(guān)內(nèi)容的現(xiàn)象；無受試者被剔除或退出試驗；受試者未見不良反應(yīng)。

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Study on the Bioequivalence of 2 Kinds of Racecadotril Preparations in Healthy Volunteers

LI Yan，ZHOU Lun，YANG Jing，JIA Yan-yan，SONG Wei，F(xiàn)ENG Zhi-jun，LU Cheng-tao，CHEN Min-chun，WEN Ai-dong
（Dept.of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China）

OBJECTIVE：To study the bioequivalence of Racecadotril pulvis and Racecadotril granules.METHODS：A randomized crossover design was performed in 20 healthy male volunteers.A single oral dose of Racecadotril pulvis（200 mg，test preparation）or Racecadotril granules（200 mg，reference preparation）were administrated.Plasma concentrations of racecadotril were determined by LC-MS.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software and the bioequivalence was evaluated.RESULTS：After a single oral dose of 200 mg test preparation or reference preparation，the main pharmacokinetic parameters were as follows：cmax（286.54±66.14）ng·mL－1and（283.73±65.49）ng·mL－1；tmax（1.78±0.48）h and（1.68±0.79）h；t1/2（4.02±1.26）h and（4.00±1.11）h；AUC0～24h（1 353±431）ng·h·mL－1and（1 293±320）ng·h·mL－1.There was no significant difference between the two preparations in pharmacokinetic parameters by variance analysis，t test and 1－2α confidence interval method（P＞0.05）.The 90%confidence intervals of cmax，AUC0～24hand AUC0～∞of test preparation were 92.2%～111.1%，98.1%～107.7%and 98.6%～108.3%.CONCLUSION：Racecadotril pulvis and Racecadotril granules are bioequivalent in healthy volunteers.

Racecadotril；LC-MS；Bioequivalence；Pharmacokinetics

R969.1

A

1001-0408（2012）30-2836-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.30.21

＊副主任藥師，碩士。研究方向：基因藥物。電話：029-84775476。E-mail：kevin@fmmu.edu.cn

#通訊作者：主任藥師，博士。研究方向：新藥研發(fā)及臨床試驗管理。電話：029-84773636。E-mail：adwen@fumm.edu.cn

2011-10-21

2012-01-20）