慢性乙型肝炎患者外周血Treg/Th17比率的檢測及其與肝功能的相關(guān)性研究①

林振忠 余雪平 蘇智軍 郭如意 明德松 黃綠葉 蘇密龍

(福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院檢驗科，泉州362000)

我國是乙型肝炎病毒(HBV)高感染率國家，現(xiàn)有CHB患者約2 000萬人，每年約有100萬人死于HBV相關(guān)性肝臟疾病。HBV本身不引起肝臟病變，而細胞免疫介導的肝損害可導致各種急慢性肝炎[1]。CD4+T淋巴細胞，尤其是Treg和Th17細胞在HBV致病過程中發(fā)揮重要作用[2-4]。Treg與Th17細胞分別起著抗炎和促炎作用，Treg/Th17失衡可能加重肝臟免疫炎癥或促進病毒感染慢性化[4]。最近研究表明，Treg/Th17比率可能是一個有效的評估疾病嚴重程度的免疫指標[5，6]。然而，Treg/Th17比率與CHB患者肝組織免疫炎癥及病情分級的關(guān)系尚未闡明。本實驗通過檢測CHB患者外周血Treg和Th17細胞的頻數(shù)，探討Treg、Th17細胞及Treg/Th17比率與肝功能的關(guān)系，以便更好地反映CHB患者肝組織的免疫炎癥。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2010年7月～2011年8月我院住院CHB患者70例，其中男54例，女16例，年齡19～62歲，平均(30.65±14.26)歲;HBeAg陽性CHB患者41例，HBeAg陰性CHB患者29例，診斷均符合2000年(西安)全國傳染病與寄生蟲病學術(shù)會議制定的標準[7]，近3個月未接受過免疫調(diào)節(jié)劑(如胸腺肽、糖皮質(zhì)激素)、保肝及抗病毒治療，排除甲、丙、丁、戊型病毒感染及合并酒精性、藥物性、自身免疫性或代謝性肝病以及原發(fā)性肝癌。另選同期我院門診健康體檢者(HC)20例，其中男13例，女7例，年齡21～64歲，平均(36.50±13.26)歲。本實驗得到我院倫理委員會批準同意，患者簽署知情同意書。

1.2 試劑 改良型RPMI1640購自北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司;人淋巴細胞分離液和胎牛血清購自北京索萊寶科技有限公司;佛波酯(PMA)、離子霉素(Ion)、莫能菌素(Mon)、IL-17AFITC和CD127-PE單克隆抗體購自美國eBioscience公司;CD4-FITC、CD8-PE、CD3-PC5、CD25-PC5 等單克隆抗體購自美國Beckman coulter immunotech公司;破膜劑購自美國Invitrogen公司;人細胞因子TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒購自美國MARKET公司。

1.3 標本采集及細胞分離 抽取入選研究對象的外周靜脈血2管，1管3 ml(肝素抗凝)，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離PBMC，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整PBMC密度到2×106ml-1;另一管5 ml，收集血清，-80℃冰凍待ELISA檢測。

1.4 外周血Th17、Treg細胞頻數(shù)的檢測 抽取外周靜脈血3 ml(肝素抗凝)，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離PBMC，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整PBMC密度到2×106ml-1，將2 ml PBMC懸液加入至6孔板內(nèi)，再加入佛波酯(25 ng/ml)、離子霉素(1 μg/ml)和莫能菌素(1.7 μg/ml)(以上均為工作濃度)，37℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5小時。收集細胞后分為測定管和對照管各 100 μl，加入 10 μl CD3-PC5 和 20 μl CD8-PE單克隆抗體，室溫避光孵育15分鐘。100μl固定液(A液)室溫避光固定反應(yīng)15分鐘后，加入3 ml PBS，混勻后離心棄去上清。加入100 μl破膜劑(B液)進行細胞打孔利于細胞因子染色，測定管加入 IL-17A-FITC 20 μl，對照管加入 20 μl同型對照，室溫避光孵育20分鐘后，再加入3 ml PBS，靜置10分鐘，離心棄去上清液，再加入0.5 ml PBS重懸，上機檢測。應(yīng)用流式細胞儀(Beckman coulter Epics XL型，美國 Beckman公司)，根據(jù) CD3、CD8設(shè)門以圈定T淋巴細胞群，對 Th17細胞(CD3+CD8-IL-17+T)進行檢測。

取100 μl靜脈血，加入CD4-FITC和CD127-PE單克隆抗體各 20 μl，CD25-PC5 單克隆抗體 10 μl，混勻后避光孵育20分鐘，再加入2 ml紅細胞裂解液，混勻后避光孵育20分鐘，加3 ml PBS洗滌1次后，再加入0.5 ml PBS重懸，上機檢測。應(yīng)用流式細胞儀對Treg細胞(CD4+CD25highCD127lowT)進行檢測。

1.5 血清TGF-β1的檢測 取上述凍存的血清，通過ELISA雙抗體夾心法檢測細胞因子TGF-β1，具體操作按照試劑盒提供的說明書進行，在酶標儀(Alisei Quality System，意大利SEAC公司)450 nm處讀取數(shù)據(jù)。

1.6 肝功能指標檢測 采用全自動生化儀(Beckman LX-20，美國 Beckman公司)檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)等肝功能指標，試劑由美國Beckman公司提供。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，各組間采用Mann-Whitney U檢驗;治療前后采用Wilcoxon配對T檢驗;相關(guān)性檢驗采用Spearman's相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的臨床資料 CHB組和正常對照組年齡、性別具有可比性(P＞0.05)，見表1。

表1 各組研究對象的臨床資料(±s)Tab．1 Clinical data of each group(±s)

表1 各組研究對象的臨床資料(±s)Tab．1 Clinical data of each group(±s)

Note:Compared with healthy control，the liver function indicators were higher in the CHB group，the age and gender were almost the same between the two group.

CHB HC CHB VS HC HBeAg positive HBeAg negative P N(n)＜0.001 Gender(male)Age(year)TBil(μmol/L)DBil(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)20 13(65%)36.50±13.26 19.00±4.75 16.23±3.28 16.40±1.91 13.35±1.12 41 29(70.7%)30.58±10.01 71.35±103.36 39.29±60.20 510.11±499.95 277.14±324.03 29 23(79.3%)36.75±10.00 64.02±82.31 36.42±50.31 480.97±712.25 258.07±322.07 0.419 0.315＜0.05＜0.05＜0.001

圖1 健康對照組與CHB組Treg、Th17細胞(%)和Treg/Th17比率的比較Fig．1 Frequency of Treg and Th17 cells and the ratio of Treg/Th17 in patients with chronic hepatitis B and healthy controls

圖2 Treg細胞(%)與各肝功能指標的相關(guān)性分析Fig．2 The relationship between the frequency of Treg cells and liver function indicators

2.2 CHB患者外周血Treg、Th17細胞頻數(shù)及Treg/Th17比率的檢測結(jié)果 CHB患者Treg細胞頻數(shù)[(7.04±2.41)%]明顯高于健康對照者[(5.83±1.07)%，P=0.025];Th17細胞頻數(shù)[(0.23±0.16)%]也明顯高于健康對照者[(0.11±0.05)%，P=0.005]，CHB患者 Th17細胞升高較Treg細胞明顯，Treg/Th17比率(56.72±60.37)低于健康對照者(76.09±68.49，P=0.047)，見圖1。

2.3 Treg和Th17細胞與肝功能的相關(guān)性 CHB患者 Treg細胞與TBil、DBil、AST 呈正相關(guān)(P ＜0.05)，Th17細胞與以上指標均無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，見圖2。

2.4 Treg/Th17比率與肝功能的相關(guān)性 HBeAg陽性CHB患者Treg/Th17比率與總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)呈正相關(guān)(P＜0.05);HBeAg陰性CHB患者Treg/Th17比率與ALT呈負相關(guān)(P＜0.05)，見圖3。

圖3 Treg/Th17比率與各肝功能指標的相關(guān)性Fig．3 The relationship between the ratio of Treg/Th17 and liver function indicators

圖4 Treg/Th17比率和TGF-β1與CHB病情分級的關(guān)系Fig．4 The relationship between the ratio of Treg/Th17 and TGF-β1 and the grade of liver injury

圖5 23例HBeAg陽性CHB患者隨訪時Treg/Th17比率與肝功能指標相關(guān)性Fig．5 The relationship between the ratio of Treg/Th17 and liver function indicators in 23 HBeAg positive CHB after therapy

2.5 Treg/Th17比率和TGF-β1與CHB病情分級的關(guān)系 本研究分析了41例HBeAg陽性CHB患者。其中輕度3例，中度25例，重度13例。數(shù)據(jù)顯示，Treg/Th17比率隨病情加重而升高，但差異不明顯，而各組間 TGF-β1差異明顯，且 TGF-β1與 ALT呈正相關(guān)，見圖4。

2.6 綜合治療后Treg/Th17比率與肝功能的相關(guān)性 本研究共23例HBeAg陽性CHB患者接受隨訪，平均隨訪(2.02±1.91)月。數(shù)據(jù)顯示，綜合治療(保肝及核苷(酸)類似物抗病毒)后，CHB患者的肝功能指標(TBil、DBil、ALT、AST)、Treg 細胞頻數(shù)及TGF-β1均明顯下降(P＜0.01)，Th17細胞卻有所升高，表現(xiàn)為Treg/Th17比率下降(P＞0.05)。Treg/Th17比率與TBil呈正相關(guān)(P＜0.05)，與ALT等趨向正相關(guān)(P＞0.05，見圖5)。

3 討論

免疫介導的肝臟炎癥在HBV致病過程中發(fā)揮著重要的作用。近來年，研究的焦點主要集中于功能失調(diào)的Treg和Th17細胞。Treg細胞通過表達特異性的轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)和分泌IL-10、TGF-β1等細胞因子，介導自身免疫耐受和維持免疫平衡[8，9]。Th17 細胞通過分泌 IL-17、IL-22、GM-CSF、IL-6 等細胞因子，參與惡性腫瘤、酒精性肝病和自身免疫性疾病等免疫病理反應(yīng)[10]。其中IL-17是T細胞誘導的炎癥反應(yīng)的早期啟動因素，在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中起促進作用[11]。多數(shù)研究認為Treg細胞功能缺陷和Th17細胞上調(diào)可能是導致CHB病情進展的重要因素[2，4]。本實驗顯示，CHB 患者外周血中 Treg和Th17細胞明顯增加，但Treg細胞增加比例不及Th17細胞，Treg/Th17平衡被打破，導致促炎因子Th17細胞處于相對優(yōu)勢地位，而抑炎因子Treg細胞相對缺乏，進而導致CHB肝臟免疫炎癥的發(fā)生。

應(yīng)注意的是，Treg/Th17平衡不僅與CHB致病機制相關(guān)，而且還與肝組織免疫炎癥相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)隨著病情進展，HBeAg陽性 CHB患者 Treg/Th17比率呈升高趨勢，而TGF-β1水平明顯升高。由于低水平TGF-β1促進Th17分化，而高水平TGF-β1有助于Treg細胞產(chǎn)生[2]。因此隨著 CHB病情進展，Treg細胞和TGF-β1之間形成正反饋，導致Treg細胞逐漸增多，因而Treg/Th17比率也隨著升高。增多的Treg細胞可能扮演著抑制功能過度亢進的Th17細胞的角色，從而有利于維持免疫平衡，減輕肝組織損傷，進而防止病情進展至肝功能衰竭[3]。相關(guān)性發(fā)現(xiàn) HBeAg陽性 CHB患者，Treg/Th17比率與TBil、DBil、ALT等肝臟炎癥指標呈正相關(guān)，進一步提示Treg/Th17比率在一定程度上反映了肝臟的免疫炎癥程度。在HBeAg陰性患者中，我們卻發(fā)現(xiàn)相反的情況，Treg/Th17比率與ALT呈負相關(guān)?？赡艿慕忉尀?HBeAg陽性CHB患者主要處于免疫清除早期，Treg細胞仍維持在高水平階段，有利于維持免疫耐受，而HBeAg是介導免疫耐受(主要與Treg細胞有關(guān))的主要因子[12];HBeAg陰性患者則處于免疫再活動期，?？蛇M展為肝纖維化、肝硬化、失代償肝硬化和HCC[7]，與Th17細胞分泌的特征性IL-17有關(guān)[13];因此 HBeAg陽性 CHB患者可能以Treg細胞為主要優(yōu)勢，而HBeAg陰性CHB患者主要是Th17細胞起主要作用，這從本實驗中Treg細胞與TBil、DBil、AST呈正相關(guān)得到證實。

以往研究表明，阿德福韋酯治療能減少外周血中Treg細胞頻數(shù)，進而影響宿主免疫反應(yīng)[14]。本實驗隨訪資料顯示，隨著肝臟炎癥緩解，HBeAg陽性CHB患者Treg細胞頻數(shù)明顯下降，而Th17細胞頻數(shù)有所上升，Treg/Th17比率伴隨TBil下降而下降，進一步表明Treg/Th17比率與肝臟免疫炎癥相關(guān)。不足的是，本研究缺乏系統(tǒng)的隨訪資料，從而無法觀察到Treg/Th17比率與肝臟免疫炎癥的動態(tài)變化。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)Treg細胞及Treg/Th17比率與肝功能指標具有良好的相關(guān)性，Treg/Th17比率在一定程度上反映了肝組織免疫炎癥程度。檢測Treg、Th17細胞頻數(shù)及其比率，能較好地反映CHB患者肝組織的免疫炎癥。

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