人β-防御素2聯(lián)合乙肝疫苗對(duì)小鼠免疫效應(yīng)的研究①

曾文興 蘇 虹 王美珍 劉玉琳 王福財(cái) 胡有長(zhǎng) 江麗霞 施橋發(fā) (南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南昌330006)

乙型肝炎是乙型肝炎病毒(HBV)感染引起最常見(jiàn)的全球性肝臟疾病[1]。據(jù)估計(jì)，全世界有20億人已感染乙型肝炎病毒(HBV)，其中3.6億存在慢性感染、肝硬化、肝癌或并發(fā)其他嚴(yán)重疾病或死亡的風(fēng)險(xiǎn)。幾十年來(lái)以明礬為佐劑的乙肝疫苗接種在防治乙肝病毒感染中發(fā)揮了重要作用。但有報(bào)道稱在一些尿毒癥和其他免疫缺陷疾病等免疫功能抑制患者中，由于保護(hù)性機(jī)制存在不足，導(dǎo)致鋁佐劑的佐劑作用效應(yīng)不明顯，不能誘導(dǎo)有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答，使疫苗接種成功率降低[2]。因此，科學(xué)界一直在努力尋找更有效的疫苗佐劑來(lái)增強(qiáng)乙肝疫苗免疫效果。

防御素是一類富含半胱氨酸的內(nèi)源性抗菌肽，它的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有廣泛的抗細(xì)菌、真菌和部分病毒的作用[3-8]。按照分子結(jié)構(gòu)特征及來(lái)源不同，動(dòng)物防御素可分為 α-防御素、β-防御素和 θ-防御素 3 種[9，10]。最近研究表明，防御素-2(BD2)是防御素家族的重要成員，被認(rèn)為是聯(lián)系先天免疫和獲得性免疫的橋梁。許多研究都表明人β-防御素2具有細(xì)胞趨化的活性[11，12]，通過(guò) CCR6趨化記憶 T細(xì)胞和未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，并可以促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟[13-16]，加強(qiáng)抗原遞呈作用，從而加強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。本研究中我們采用含 HBD2基因的質(zhì)粒pEGF-C1/HBD2聯(lián)合乙肝疫苗免疫小鼠，觀察HBD2增強(qiáng)乙肝疫苗免疫效果的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與試劑 BALB/c小鼠(雌性，6～8周齡，每只18～22克，SPF級(jí))，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供;CD8-FITC/CD4-PE/CD3-PerCP，購(gòu)自BD公司;重組乙型肝炎疫苗，每支1.0 ml(20 μg/ml)，北京天壇生物制品股份有限公司;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量試劑盒購(gòu)自天根生物技術(shù)公司。乙肝表面抗體診斷試劑盒購(gòu)自英科新創(chuàng)科技有限公司。

1.1.2 儀器 酶標(biāo)儀(model 3550，Biorad公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(Napco公司，法國(guó));ELX-800型流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó));低溫離心機(jī)(科大創(chuàng)新KDC-2046)。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提 抽提步驟參照天根公司試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行質(zhì)粒抽提。其主要步驟如下:收集菌液，離心并收集細(xì)菌沉淀;加入溶液P1重懸細(xì)菌，加入溶液P2，室溫放置5分鐘，加入溶液P3，立即混勻，室溫放置5分鐘后離心，將離心后得到的上清液加入到吸附柱AC中離心，棄廢液;向AC柱中加入E-WB，離心棄廢液，加入洗液WB，離心棄廢液，取出吸附柱AC，放到一個(gè)干凈離心管中，在吸附膜中加入EB緩沖液將其重新溶解后離心收集濾液。通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒的OD值，計(jì)算純度和濃度。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和免疫接種及采血 4～6周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，在小鼠股四頭肌注射小鼠，分別在第二周和第四周加強(qiáng)免疫1次。小鼠分組及免疫計(jì)量如下:第一組:PBS組免疫PBS 200 μl，第二組免疫2 μg乙肝疫苗，第三組將2 μg乙肝疫苗聯(lián)合100 μg pEGF-C1質(zhì)?；旌虾竺庖?，第四組:100 μg pEGF-C1/HBD2質(zhì)粒聯(lián)合2 μg乙肝疫苗混合后免疫，保證每只免疫小鼠200 μl等體積，在第三次免疫后兩周眼眶采血，離心收集血清。

1.2.3 小鼠血清乙肝表面抗體檢測(cè) 用ELISA檢測(cè)試劑盒通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)小鼠血清中總乙肝表面抗體OD值:在預(yù)包被的96孔板中分別加入稀釋的血清50 μl;另設(shè)一組空白對(duì)照。然后加入酶標(biāo)試劑50 μl，混勻，37℃溫育1小時(shí);洗滌6次，每孔加入顯色劑A、B各50 μl;輕輕振蕩，37℃避光顯色20分鐘;每孔加入終止液50 μl，混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值。

1.2.4 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 免疫后的小鼠脾臟制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，用10%小牛血清含雙抗1640調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml-1，取96孔板，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，分別加入刺激物 ConA 5 μg/ml，乙肝疫苗0.2 μg/ml和1640作為控制組。一式三份，每孔終體積為200 μl，另設(shè)調(diào)零孔。培養(yǎng)板放于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)，在結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入20 μl CCK8繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔A450OD值。

1.2.5 脾細(xì)胞指數(shù)檢測(cè) 第三次免疫后兩周，稱量小鼠體重，頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌取脾臟，并稱各小鼠脾重，按公式計(jì)算脾臟指數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+/CD4+T細(xì)胞與CD3+/CD8+T細(xì)胞數(shù)值與比例 將脾制成單個(gè)細(xì)胞懸液后用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度，將購(gòu)買的熒光抗體CD3∶CD8∶CD4=2∶2∶1 體積比例混合后，按每 100 μl單個(gè)核細(xì)胞懸液(濃度107個(gè)/ml)中加入10 μl混合抗體，充分混勻后，室溫避光孵育30分鐘。用PBS 300 μl重懸，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以不加抗體的細(xì)胞為背景對(duì)照，以CD3分子設(shè)門，進(jìn)一步檢測(cè)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS19軟件進(jìn)行處理。檢驗(yàn)前各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成為正態(tài)分布數(shù)據(jù)后再進(jìn)行方差分析，對(duì)方差分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的各組采用SNK法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人β-防御素2對(duì)小鼠HBsAb的影響 采用雙抗原夾心ELISA法對(duì)免疫三次后各組小鼠血清中HBsAb水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示乙肝疫苗聯(lián)合pEGF-C1/HBD2質(zhì)粒免疫組抗體水平最高，且明顯高于乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1質(zhì)粒免疫組和PBS對(duì)照組(P＜0.05)，但與乙肝疫苗組相比增高不明顯(P＞0.05)，說(shuō)明人β-防御素2可能具有增強(qiáng)小鼠對(duì)乙肝疫苗體液免疫應(yīng)答的功能。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

2.2 細(xì)胞體外增殖反應(yīng) 采用CCK8試劑盒通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值，觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖情況。結(jié)果在分別以PBS、ConA和HBsAg等3種不同物質(zhì)為體外試驗(yàn)刺激物的試驗(yàn)中，均觀察到乙肝疫苗聯(lián)合pEGF-C1/HBD2免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力比其它免疫組小鼠明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，且乙肝疫苗免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力比PBS組和乙肝疫苗聯(lián)合pEGF-C1免疫組強(qiáng)(P＜0.05)。在同一免疫組內(nèi)，不同體外刺激物作用下的各個(gè)小組之間，ConA與乙肝疫苗對(duì)細(xì)胞的刺激增殖作用都比Control強(qiáng)(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 不同免疫組小鼠血清HBsAb OD450值(±s，n=5)Tab．1 OD450 values of the mouse serum HBsAb(±s，n=5)

表1 不同免疫組小鼠血清HBsAb OD450值(±s，n=5)Tab．1 OD450 values of the mouse serum HBsAb(±s，n=5)

Note:A，B，C and D indicate the mice groups immunized with PBS，HB-sAg vaccine，HBsAg vaccine combined with pEGF-C1 and HBsAg vaccine combined with pEGF-C1/HBD2，respectively.1)P ＜0.05，group D is compared with group A and C;2)P ＞0.05，group D is compared with group B.

Group OD450value PBS(A)0.006±0.001 HBsAg(B) 1.422 2±0.568 HBsAg combined pEGF-C1(C) 1.109±0.211 HBsAg combined pEGF-C1/HBD2(D) 1.765 3±0.586 1)2)

圖1 各免疫組小鼠血清總HBsAb OD450值Fig．1 OD450 values of the mouse serum total HBsAb

表2 不同免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞體外刺激增殖效應(yīng)(OD450，±s，n=5)Tab．2 The proliferation effective of the spleen lymphocytes from various groups(OD450，±s，n=5)

表2 不同免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞體外刺激增殖效應(yīng)(OD450，±s，n=5)Tab．2 The proliferation effective of the spleen lymphocytes from various groups(OD450，±s，n=5)

Note:1)Compared with other groups stimulated with PBS in vitro，P ＜0.05;2)Compared with other groups stimulated with ConA in vitro，P ＜0.05;3)Compared with other groups stimulated with HBsAg in vitro，P ＜0.05;4)Compared with other stimulating groups in vitro immunized with HBsAg invivo，P ＜0.05;5)Compared with other stimulating groups in vitro immunized with HBsAg combined pEGF-C1 in vivo，P ＜0.05;6)Compared with other stimulating groups in vitro immunized with HBsAg combined PEGF-C1/HBD2，P＜0.05.

Immunized groups in vivo Stimulating groups in vitro PBS ConA HBsAg PBS HBsAg HBsAg combined pEGF-C1 HBsAg combined pEGF-C1/HBD2 0.32±0.01 0.37±0.01 0.30±0.01 0.64±0.011)0.34±0.01 0.39±0.01 0.36±0.02 0.54±0.052)0.37±0.01 0.42±0.014)0.38±0.035)0.79±0.033)6)

表3 各組之間小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+T細(xì)胞及CD3+CD8+T細(xì)胞的比較(±s，n=8)Tab．3 The percents of the CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in the spleen lymphocytes from various groups(±s，n=8)

表3 各組之間小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+T細(xì)胞及CD3+CD8+T細(xì)胞的比較(±s，n=8)Tab．3 The percents of the CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in the spleen lymphocytes from various groups(±s，n=8)

Note:1)P ＜0.05，for the value of the percent of CD3 and CD4 double positive T cell，compared with other 3 groups;2)P ＜0.05，for the value of the percent of CD3 and CD8 double positive T cell，compared with other 3 groups;3)P ＜0.05，for the value of the percent of CD3 and CD8 double positive T cell，compared with PBS group;4)P ＜0.05，for the value of CD4+/CD8+T cell，compared with other 3 groups;5)P ＜0.05，for the value of the percent of CD4 and CD8 double positive T cell，compared with HBsAg group.

Groups CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%) CD4+/CD8+PBS 14.94±6.62 27.00±4.71 0.577±0.27 HBsAg 12.69±3.47 38.70±5.502) 0.33±0.11 HBsAg combined pEGF-C1 12.31±1.54 19.49±5.453) 0.66±0.175)HBsAg combined pEGF-C1/HBD2 23.20±2.191) 23.02±2.10 1.01±0.014)

圖2 流式分析各免疫組小鼠脾臟CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細(xì)胞百分率Fig．2 The percents of the CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in the spleen lymphocytes from various groups

2.3 各免疫組小鼠T細(xì)胞功能亞群檢測(cè) 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，與其他組相比，乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1/HBD2免疫組CD4+T細(xì)胞百分率明顯升高(P＜0.05)，而乙肝疫苗免疫組和乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫組與PBS組相比，CD4+T細(xì)胞百分率均有輕微下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CD8+T細(xì)胞百分率在乙肝疫苗免疫組百分率最高，與其他相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1/HBD2免疫組+T細(xì)胞百分率比乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫組更高，但兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫組+T細(xì)胞百分率比PBS組明顯下降(P＜0.05)。乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1/HBD2免疫組CD4+/CD8+T細(xì)胞比值顯著提高，與其他組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫組比乙肝疫苗免疫組也有顯著升高(P＜0.05)，但與PBS組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05 )，結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

表4 各種免疫組小鼠脾臟指數(shù)(±s，n=5)Tab．4 The spleen index of the mice immunized(±s，n=5)

表4 各種免疫組小鼠脾臟指數(shù)(±s，n=5)Tab．4 The spleen index of the mice immunized(±s，n=5)

Note:1)P＞0.05，compared with other 3 groups.

Groups Spleen index(mg/g)PBS 8.22±0.20 HBsAg 8.30±0.15 HBsAg and pEGF-C1 8.61±0.18 HBsAg and pEGF-C1/HBD21)8.32±0.23

2.4 脾臟指數(shù) 通過(guò)對(duì)各免疫組小鼠的體重和脾臟重量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明各免疫組小鼠脾細(xì)胞指數(shù)差異沒(méi)有顯著意義(P＞0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

近年來(lái)，以明礬為佐劑的乙肝疫苗用于預(yù)防接種和防止乙肝病毒感染中發(fā)揮了重要作用。但有相關(guān)報(bào)道在一部分人群中不會(huì)誘導(dǎo)特異性抗體生成，且明礬不輔助細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此科研人員一直在努力尋找更有效的疫苗佐劑來(lái)增強(qiáng)疫苗的免疫效應(yīng)。有些試驗(yàn)也取得了一定的成果，但是仍然有一定局限性。

在本研究中，通過(guò)對(duì)各免疫組小鼠血清乙肝表面抗體水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)含有HBD2基因的質(zhì)粒免疫后，小鼠產(chǎn)生的血清抗體比單獨(dú)乙肝疫苗免疫產(chǎn)生的抗體含量明顯增加，因此人-β防御素2能夠提高機(jī)體對(duì)乙肝疫苗產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)，從而提高保護(hù)抗體水平，更好的預(yù)防HBV感染。

一些研究者已經(jīng)證明通過(guò)促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原的攝取、加工和遞呈，可使更多的抗原被給予組織相容性抗原相關(guān)的輔助性T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞增殖和分化[17]。本文研究了以HBD2為佐劑的乙肝疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞的體外增殖效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)用乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1/HBD2質(zhì)粒免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出比其他組更高水平的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。這種情況可能與人-β防御素2在小鼠體內(nèi)促進(jìn)了樹(shù)突狀細(xì)胞趨化與成熟，增強(qiáng)了外源性抗原遞呈，激活了更多的CD4+T細(xì)胞，顯著提高了CD4+T的百分率或者其活性有關(guān)。有研究認(rèn)為Al(OH)3作為佐劑，可能具有雙重效應(yīng)，在小劑量時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，而在大劑量時(shí)會(huì)產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，小劑量乙肝疫苗在體外可以較好地刺激T細(xì)胞增殖，其效應(yīng)甚至比ConA更強(qiáng)，表明乙肝疫苗可以有效刺激免疫細(xì)胞增殖，產(chǎn)生較好免疫效應(yīng)，但這種效應(yīng)是否與作為佐劑的Al(OH)3有關(guān)，還需要更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

宿主的免疫功能特別是細(xì)胞免疫功能對(duì) HBV感染后的臨床轉(zhuǎn)歸有重要作用[18-20]。國(guó)內(nèi)外研究初步表明，慢性乙型肝炎患者體內(nèi)細(xì)胞免疫功能不足，T淋巴細(xì)胞亞群失衡，使機(jī)體不能有效清除入侵的乙肝病毒，導(dǎo)致疾病的慢性化[21-23]。而本研究發(fā)現(xiàn)HBD2可能存在提高乙肝疫苗細(xì)胞免疫功能的作用，從而可能更好地防治HBV感染。

機(jī)體正常免疫功能是由各種淋巴細(xì)胞亞群間的相互作用來(lái)維持的，T淋巴細(xì)胞亞群中的CD4+T和CD8+T細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞活性，參與細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。其中CD3/CD4雙陽(yáng)性輔助性T細(xì)胞其主要功能是輔助誘導(dǎo)其他免疫細(xì)胞增殖和分化，調(diào)節(jié)免疫功能。而CD3/CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞群體，可特異性殺傷靶細(xì)胞，具有抗病毒、抗腫瘤和重要的免疫調(diào)節(jié)作用。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)、比較了不同免疫組小鼠中脾細(xì)胞表面分子CD4+T和CD8+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值，發(fā)現(xiàn)與PBS組相比，乙肝疫苗對(duì)小鼠CD4+T細(xì)胞無(wú)明顯激活促進(jìn)效應(yīng)，但對(duì)小鼠CD8+T細(xì)胞具有明顯的激活作用。而乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫小鼠后，與PBS對(duì)照組相比CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞百分率都表現(xiàn)為一定程度的下降，并且后者下降程度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)為對(duì)乙肝疫苗細(xì)胞免疫效應(yīng)具有一定抑制作用。乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1/HBD2免疫小鼠后，對(duì)CD4+T細(xì)胞百分率比單獨(dú)使用乙肝疫苗的免疫組和乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫均有更好的激活作用，但對(duì)CD8+T細(xì)胞百分率沒(méi)有顯著提高作用。表明pEGFP-C1/HBD2質(zhì)粒免疫可以在一定程度上提高乙肝疫苗免疫小鼠CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例，對(duì)免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)具有重要意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)人-β防御素2對(duì)乙肝疫苗在小鼠中的免疫功能有一定增強(qiáng)作用，尤其是CD4+T淋巴細(xì)胞帶來(lái)的Th細(xì)胞效應(yīng)更為明顯。因此HBD2可能具有一定的增強(qiáng)乙肝疫苗免疫保護(hù)作用的佐劑效應(yīng)。本研究對(duì)探討適用于增強(qiáng)乙肝疫苗免疫效應(yīng)的新型免疫佐劑有重要意義。

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