可溶性死亡受體5在化療前后肺癌患者外周血中的檢測①

朱詩白 楊永杰 劉瑞敏 張愛紅 孫潁川 白慧玲

(河南大學醫(yī)學院免疫學研究所河南大學細胞與分子免疫學重點實驗室，開封475004)

隨著細胞凋亡研究的深入，發(fā)現(xiàn)凋亡參與了許多疾病的病理損傷。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是新近發(fā)現(xiàn)的TNF家族新成員，由于其能夠誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無影響[1]，從而成為國際上的研究熱點。而其主要受體DR5是腫瘤壞死因子受體超家族成員，在多種腫瘤組織中高度表達。在調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。目前的研究多集中在DR5抗體的制備及其誘導細胞凋亡的作用機制等方面[3]。但TRAIL受體-DR5脫落或分泌與體液后的消退情況與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后是否有關(guān)，尚未見報道，該方面將會是TRAIL研究中值得探討的新領(lǐng)域。

基于以上原因我們利用基因工程技術(shù)制備人TRAIL受體DR5，進而制備抗DR5的單克隆抗體和抗DR5多可隆抗體[4-5]。建立了檢測可溶性 DR5(sDR5)的雙抗夾心ELISA法[6]，為檢測腫瘤患者體液中sDR5量提供一種簡單、特異的檢測方法。并且檢測了肺癌病人治療前后血清中sDR5的含量變化，發(fā)現(xiàn)腫瘤病人血清中sDR5的含量高于正常人群，而治療后病人血清中sDR5含量明顯降低，希望此發(fā)現(xiàn)為我們探討腫瘤的發(fā)生機制、腫瘤預后，提供新的思路和新的指標。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究中所有研究對象健康人群組和肺癌患者組來自河南大學淮河醫(yī)院及安陽市腫瘤醫(yī)院，其中腫瘤患者組79例，健康人群組106例，均為男性，年齡分布見表1。

腫瘤患者組:腫瘤病例均來源于2008年5月～2011年3月在淮河醫(yī)院及安陽市腫瘤醫(yī)院確診的腫瘤患者。正常人群組:選擇同期年齡相匹配的在門診健康體檢者作為正常人群組，正常人群組所有入選者均無腫瘤病史、癥狀及體征。經(jīng)均衡性檢驗，腫瘤組和健康組的年齡均無顯著差異(P=0.14，P=0.25)，見表2。表明本研究所收集資料偏差小，可信度高，數(shù)據(jù)可靠。

1.2 血樣采集 取住院后肺癌患者手術(shù)化療一個療程前后及健康體檢者清晨空腹全血3 ml，及時分離血清，避免溶血及高血脂標本，密閉凍存于-20℃，集中測定。

1.3 材料與試劑 DR5純品(由賓夕法尼亞大學醫(yī)學院陳有?；葙浀闹亟M畢氏酵母通過同源重組分泌高水平sDR5，經(jīng)用Ni-NTA純化);鼠抗人DR5單克隆抗體、兔抗人 DR5多克隆抗體均為本室制備[4，5];辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG、96 孔微孔板(購于上海基因生物工程有限公司);酶聯(lián)免疫分析儀:model354，芬蘭Labsystems公司生產(chǎn);酶聯(lián)微量反應板:丹麥Nunc公司生產(chǎn);TMB顯色液:Sigma公司;碳酸鹽包板液、ELISA封閉液、PBS洗板液自行配制。

1.4 檢測sDR5夾心ELISA方法的建立 用2.5 μg/ml抗DR5單抗包被酶標板，4℃孵育24小時，PBS洗滌后加5%小牛血清封閉，4℃孵育24小時，洗滌，加倍比稀釋的DR5標準品，100 μl/孔，37℃孵育1 小時洗滌，加兔抗 DR5 多抗(5 μg/ml)，100 μl/孔，37℃孵育1小時，充分洗滌，加入1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗兔 IgG，100 μl/孔，37℃孵育1小時，洗滌8次后加入TMB底物(Sigma)，37℃孵育15分鐘，2 mol/L H2SO4終止反應，酶聯(lián)免疫分析儀:model354測定A450。以DR5標準濃度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制標準曲線[6]。

表1 研究對象、年齡Tab．1 Objects studied，age distribution

表2 病例組與對照組的均衡性檢驗Tab．2 Balanced test of cases and control groups

1.5 血清中sDR5的檢測 根據(jù)上述建立的檢測DR5的方法，加入100 μl正常人或肺癌患者治療前后血清標本(每個血清標本3個復空)，余步驟相同，通過標準曲線查到相應標本中的DR5含量，重復3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學分析 所有統(tǒng)計分析使用SPSS13.0軟件。正常人群及肺癌患者之間血清DR5抗體OD值差異使用One Way ANOVA方法進行分析。

2 結(jié)果

2.1 正常人群中血清sDR5的檢測 通過對這106名健康人群的血清樣本進行ELISA夾心測定，發(fā)現(xiàn)正常人群血清中sDR5含量近正態(tài)分布，為(6.25±3.09)μg/L，大部分正常人血清中sDR5含量均在10 μg/L 以下(圖1)。

圖1 正常人群中血清sDR5含量Fig．1 The content of sDR5 in normal serum crowd

圖2 肺癌患者血清中sDR5含量Fig．2 The content of sDR5 in lung cancer serum crowd

圖3 肺癌患者治療后血清中sDR5含量Fig．3 The content of sDR5 in lung cancer serum crowd after treatment

圖4 肺癌患者與正常人群血清中sDR5含量的比較Fig．4 Comparison of value of sDR5 in patients with lung cancer and normal serum crowd

2.2 肺癌患者中sDR5的檢測 肺癌患者治療前血清中sDR5的水平近正態(tài)分布，所有肺癌患者血清中sDR5的水平均高于10 μg/L，明顯高于正常人群，為(53.91±13.42) μg/L，見圖2。79例肺癌患者化療后肺癌患者血清中sDR5水平明顯降低，呈偏態(tài)分布，為(23.99±14.23) μg/L，見圖3。

2.3 肺癌患者與正常人群血清中sDR5的比較正常人群與肺癌患者的血清中sDR5的水平存在差異，肺癌患者的sDR5含量在(53.91±13.42)μg/L明顯高于正常人群(6.25±3.09)μg/L，P＜0.001，見圖4。肺癌患者手術(shù)后化療一療程后血清中sDR5水平明顯比治療前降低(23.99±14.23)μg/L，P＜0.01，見圖4。

3 討論

腫瘤形成及轉(zhuǎn)移是一復雜的多階段連續(xù)過程，受多種因素的影響[7，8]，由于免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，使大部分的惡性細胞在早期被體內(nèi)正常的免疫系統(tǒng)清除[9]。

死亡受體5(DR5)屬于腫瘤壞死因子受體超家族，主要表達于腫瘤細胞，而在正常細胞不表達或者表達低，其配體TRAIL與其結(jié)合啟動細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導，誘導細胞凋亡[10]。DR5為Ⅰ型跨膜蛋白，表達于胎兒肝臟、肺臟，成人外周血、卵巢、脾臟、肝臟、肺臟等[11]。很多研究發(fā)現(xiàn)TRAIL分子不但在腫瘤患者血清升高，在高血壓、冠心病、心肌病等引起的心衰患者血清亦升高[12]。而TRAIL受體-DR5脫落或分泌與體液后的消退情況與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后是否有關(guān)，尚未見報道，該方面將會是TRAIL研究中值得探討的新領(lǐng)域。為此我們采用基因工程技術(shù)制備大量的DR5，進而制備抗DR5的兩株特異性單克隆抗體，旨在建立一種檢測可溶性DR5的夾心ELISA方法，為檢測腫瘤患者體液中DR5量提供一種簡單、特異的檢測新方法，為sDR5的基礎(chǔ)和臨床應用研究提供了有力的手段。

我們的檢測結(jié)果顯示，正常人群與肺癌患者的血清中sDR5的水平存在差異，肺癌患者的sDR5含量在(53.91±13.42)μg/L明顯高于正常人群(6.25±3.09) μg/L，P＜0.001。肺癌患者手術(shù)后化療一療程后血清中sDR5水平明顯比治療前降低(23.99±14.23)μg/L，P＜0.01。一定程度上揭示了腫瘤細胞可能會通過細胞表面DR5脫落方式阻止或延緩凋亡的發(fā)生，以利于其自身的生存。大量的腫瘤細胞死亡，DR5被清除，所以腫瘤化療后血清中sDR5水平明顯降低。所以sDR5水平在腫瘤病人不同時期含量不同，進行血清DR5的檢測有可能作為判斷腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后的一個指標。希望此發(fā)現(xiàn)能為我們探索腫瘤新的診斷指標提供新思路[13]。

1 Wiley S R，Schooley K，Smolak P J et al．Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis[J].Immunity，1995;3:673-682.

2 Link H，Xiao B G.Rat models as tool to develop new immunothera-pies[J].Immunol Rev，2001;184(1):117-128.

3 Poulas K，Tsouloufis T，Tzartos S J.Treatment of passively transferred experim ental autoimmune myasthenia gravis using papain[J].Clin Exp Immunol，2000;120(2):363-368.

4 白慧玲，趙粵萍，劉廣超et al.抗死亡受體-5單克隆抗體的制備及特性鑒定[J].細胞與分子免疫學雜志，2006;22(4):514-520.

5 白慧玲，裴景堂，杜耀武et al.兔抗人DR5分子多克隆抗體的制備與初步應用[J].免疫學雜志，2008;24(6):634-637.

6 白慧玲，劉廣超，趙粵萍et al.檢測DR5雙抗體夾心ELISA方法的建立及應用[J].河南大學學報(醫(yī)學版)，2007;26(1):21-24.

7 Kaplan D H，Shankaran V，Dighe A S et al．Demonstration of an interferon gamma-dependent tumor surveillance system in immunocompetent mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998;95(13):7556-7561.

8 Shankaran V，Ikeda H，Bruce A T et al．IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity[J].Nature，2001;410(6832):1107-1111.

9 Ellyard J I，Avery D T，Phan T G et al．Antigen-selected，immunoglobulin-secreting cells persist in human spleen and bone marrow[J].Blood，2004;103(10):3805-3812.

10 Radbruch A，Muehlinghaus G，Luger E O et al．Competence and competition:the challenge of becoming a long-lived plasma cell[J].Nat Rev Immunol，2006;6(10):741-750.

11 Sheriden J P，Marsters S A，Pitti R M et al.Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors[J].Science，1997;277(5327):818-821.

12 洪 燕，李 源，王曉明et al.老年心力衰竭患者血漿可溶性TRAIL和受體DR5水平的變化[J].心臟雜志，2003;15(2):118-120.

13 王艷鴿，李燕杰，都景芳et al.正常人群中DR5天然自身抗體的分布特點及與腫瘤患者的差異分析[J].中國免疫學雜志，2010;26(9):797-809.