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    復發(fā)性流產患者妊娠早期滋養(yǎng)細胞中E-cadherin的表達及其與HPV感染的相關性①

    2012-11-27 11:15:26郭俊成車秀英朱壯彥劉潤花趙富璽山西大同大學免疫學研究所大同037009
    中國免疫學雜志 2012年11期
    關鍵詞:滋養(yǎng)層絨毛復發(fā)性

    郭俊成 車秀英 朱壯彥 劉潤花 趙富璽 (山西大同大學免疫學研究所,大同037009)

    E-鈣粘素(E-cadherin)是介導細胞-細胞間、細胞-基質間粘附作用的細胞因子,在胚泡植入與滋養(yǎng)細胞的遷移與浸潤過程中起重要作用[1]。最近發(fā)現(xiàn),HPV16 可以抑制 E-cadherin 基因的轉錄[2],還能對體外培養(yǎng)的絨毛癌BeWo細胞的遷移、粘附產生負面影響[3],而關于人絨毛滋養(yǎng)細胞HPV感染與復發(fā)性流產相關性的報道目前相對較少。因此,本研究通過對復發(fā)性流產患者妊娠早期絨毛滋養(yǎng)細胞中E-cadherin的表達,以及HPV的感染狀況進行檢測,以探討HPV感染與復發(fā)性流產的相關性。

    1 材料與方法

    1.1 臨床資料 選擇2007年8月至2010年6月在我市各大醫(yī)院婦科門診就診的早期妊娠的復發(fā)性流產患者34例,在排除子宮畸形、宮內(細菌、真菌、原蟲等)感染、內分泌及夫婦染色體異常,以及既往無自身免疫性疾病史后作為實驗組?;颊吣挲g22 ~41歲(30.4±5.2)歲,孕期38 ~90天,孕次2~5次,流產次數(shù)2~4次;選取同期正常早孕行人工流產患者41例為對照組,年齡21~44歲(28.1±6.3)歲,對照組無不孕、自然流產、死胎等不良孕產史。兩組患者年齡、孕周、停經天數(shù)無顯著性差異。

    1.2 標本采集 復發(fā)性流產患者在確認胚胎停止發(fā)育或難免流產行清宮,以及正常早孕者行人工流產時,取其絨毛組織,立即置入10%甲醛溶液中固定24小時,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片。

    1.3 試劑和方法

    1.3.1 E-cadherin免疫組化檢測 兔抗人E-cadherin單克隆抗體及免疫組化檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。實驗步驟依照S-P試劑盒說明書進行。胞膜和/或胞漿內呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。每張切片在高倍鏡下隨機選取5個視野,陽性細胞數(shù)在5%以上記作陽性例數(shù)。計數(shù)標準為:0~5%(-),6% ~20%(+),21% ~50%(++),51% ~100%(+++)。

    1.3.2 HPV-DNA PCR法檢測 使用美國ABI 9700 PCR儀進行HPV-DNA檢測。實驗步驟為①將組織細胞加入配置好的細胞消化液以釋放細胞DNA;②選用HPV L基因區(qū)的共有引物GP5+/GP6+和β-globin基因引物Glob-F/Glob-R對所有標本進行PCR檢測;③再選用改進的共有引物PGMY09/11對所有β-globin陽性而HPV陰性的標本進行再次擴增[4](表1),這樣可檢出HPV-6、11、16、18、30、31、33、35、45、51和52。

    表1 PGMY,GP5+/6+及Glob-F/R引物序列Tab.1 PGMY,GP5+/6+and Glob-F/R primer sequences

    擴增體系包括 DNA 模板15 μl,10×Buffer液10 μl,Taq 酶 5 U,引物各 0.1 mmol/L,四種單核苷酸(dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)各 0.2 mmol/L。擴增過程:94℃預變性5分鐘,設定30個循環(huán),每個循環(huán)為 94℃20秒,39℃ (GP5+/GP6+)和 55℃(PGMY 09/11;Glob-F/Glob-R)20秒,72℃ 40秒,最后72℃延伸5分鐘。所有PCR擴增過程均包含HPV陽性、陰性對照以及β-globin基因對照。

    1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行Wilcoxon秩和檢驗、χ2檢驗(包括Fisher確切概率法),檢驗水準α=0.05。

    2 結果

    E-cadherin在實驗組與對照組的滋養(yǎng)層細胞中均有表達(圖1),但實驗組的陽性表達明顯低于對照組(表2),二者間差異具有顯著性(U=4.445,P<0.001);滋養(yǎng)層細胞中HPV-DNA檢測結果見圖2,實驗組與對照組分別檢出10例與4例,分別占29.4%和11.8%,其差異具有顯著性(P=0.039);HPV感染陽性的標本中,實驗組E-cadherin的表達水平也低于對照組(表3,P=0.015)。

    圖1 滋養(yǎng)層細胞中E-cadherin的表達(×400)Fig.1 Immunohistochemical expression of E-cadherin(×400)

    表2 流產組與正常組滋養(yǎng)層細胞中E-cadherin的表達Tab.2 Expressions of E-cadherin in trophoblast of recurrent abortions and normal groups

    圖2 HPV DNA電泳結果Fig.2 The results of HPV DNA detection

    表3 E-cadherin在流產組與正常組HPV陽性標本中的表達Tab.3 Expressions of E-cadherin in HPV positive cases of recurrent abortion and normal groups

    3 討論

    E-cadherin是一種分子量為120Ku鈣依賴性糖蛋白,主要存在于許多細胞表面與細胞外基質,在介導細胞-細胞間粘附及維持組織結構完整性方面起著重要作用。E-cadherin表達的不足將直接影響細胞-細胞、細胞-細胞外基質的粘附,以及細胞骨架的形成,并最終影響組織細胞的生長、浸潤[5]。動物實驗證明,小鼠E-cadherin基因被敲除后,其胚胎即可停止發(fā)育[6]。本實驗研究結果顯示,早期妊娠復發(fā)性流產患者絨毛滋養(yǎng)細胞中E-cadherin的表達水平明顯低于正常早孕組(表2),這提示復發(fā)性流產的發(fā)生可能與滋養(yǎng)細胞E-cadherin表達不足所導致的滋養(yǎng)細胞遷移、浸潤能力下降有關。

    絨毛滋養(yǎng)細胞HPV感染與復發(fā)性流產是否存在相關性,目前尚缺乏足夠證據(jù)。早期國內有學者認為,由于HPV非血行傳播,且衣殼蛋白質量較大,難于通過胎盤屏障,故對胎兒不構成潛在威脅[7]。最近,Weyn等在流產、早產患者及正常妊娠女性的絨毛滋養(yǎng)細胞中均檢出HPV,且認為妊娠早期的滋養(yǎng)細胞對 HPV 較妊娠中、晚期更為易感[8,9]。本次研究結果表明,早期妊娠的復發(fā)性流產患者絨毛細胞內HPV感染率(29.4%)明顯高于正常早孕組(11.8%)。因此,絨毛滋養(yǎng)細胞HPV感染很可能與復發(fā)性流產存在相關性。

    目前,關于HPV感染導致復發(fā)性流產的機制尚不明確。最近,Selma 等[3]通過 HPV16 E5、E6、E7質粒轉染體外培養(yǎng)的絨毛癌 BeWo細胞證實,HPV16能夠抑制BeWo細胞的遷移、粘附活性;同時,HPV16 E5、E6、E7蛋白對 E-cadherin基因轉錄的也有抑制作用[2]。在本實驗中,早期妊娠復發(fā)性流產患者絨毛細胞內HPV感染率明顯高于正常早孕組,而且與正常早孕組相比,復發(fā)性流產組中HPV陽性的標本更趨向于E-cadherin低水平表達(表3)。由此推斷,流產組絨毛滋養(yǎng)細胞E-cadherin低水平表達可能與HPV感染有關。HPV對E-cadherin基因轉錄的抑制作用,導致絨毛滋養(yǎng)細胞E-cadherin的表達不足,進而影響絨毛滋養(yǎng)層細胞的遷移、浸潤,最終導致流產的發(fā)生。

    綜上所述,可以認為,妊娠早期滋養(yǎng)層細胞E-cadherin的異常表達可能與復發(fā)性流產的發(fā)生有關,而HPV可能參與這一過程。

    1 Staun-Ram E,Shalev E.Human trophoblast function during the implantation process[J].Reprod Biol Endoc,2005;56(1):1-12.

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    3 Selma B,Christine W,Melody V N et al.Effects of HPV-16 E5,E6 and E7 proteins on survival,adhesion,migration and invasion of trophoblastic cells[J].Carcinogenesis,2010;31(3):473-480.

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