Toll樣受體4與膿毒癥性急性腎損傷

桂蘭蘭 綜述 謝紅浪 審校

膿毒癥是由細(xì)菌、病毒或真菌感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)。全世界每年約有1 800萬(wàn)膿毒癥患者，常合并低血壓(休克)、單一或多臟器衰竭，死亡率達(dá) 25%～70%［1，2］。急性腎損傷(AKI)是膿毒癥最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是膿毒癥患者死亡率增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，腎血流量(RBF)減少是膿毒癥性AKI的主要機(jī)制，主要依賴液體復(fù)蘇及血管活性藥物治療，但臨床療效不佳［4］。事實(shí)上，RBF在膿毒癥早期可能會(huì)減少，但復(fù)蘇后因存在高動(dòng)力循環(huán)，RBF正常甚至增加，在腎臟灌注充足情況下依然存在AKI［5］。因此，AKI發(fā)病機(jī)制遠(yuǎn)比腎臟低灌注復(fù)雜，細(xì)胞凋亡、腎小球及管周微循環(huán)障礙、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和炎癥反應(yīng)等多種因素都參與膿毒癥性AKI的發(fā)生。

Toll樣受體(TLRs)存在于固有性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細(xì)胞表面，提供病原體和生物相互作用界面。TLR4是識(shí)別革蘭陰性菌胞壁成分脂多糖(LPS)的主要受體，參與炎癥反應(yīng)。近期研究證實(shí)，阻斷TRL4信號(hào)通路可抑制炎癥介質(zhì)表達(dá)，提高膿毒癥患者生存率。本文就TLR4信號(hào)通路在膿毒癥性AKI的發(fā)病機(jī)制和治療前景作一簡(jiǎn)述。

膿毒癥性AKI的炎癥機(jī)制

凝血-炎癥網(wǎng)絡(luò)在膿毒癥病理生理機(jī)制中具有重要意義(圖1)［6］，炎癥反應(yīng)是AKI直接發(fā)病機(jī)制之一。膿毒癥過(guò)程可分為炎癥反應(yīng)和代償性抗炎反應(yīng)兩個(gè)階段。最初表現(xiàn)為明顯炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量前炎癥因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1)等，進(jìn)一步作用于巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞，刺激下游細(xì)胞因子IL-6、IL-8生成，引起組織損傷;在初始爆發(fā)性炎癥反應(yīng)后，逐漸誘發(fā)抗炎反應(yīng)，如產(chǎn)生抗炎癥因子IL-10、出現(xiàn)抗原提呈無(wú)效、T淋巴細(xì)胞低反應(yīng)性、T輔助淋巴細(xì)胞1(Th1)增生降低，使患者處于免疫麻痹狀態(tài)進(jìn)而繼發(fā)感染或?qū)χ委煾深A(yù)無(wú)效［7］。

TNF-α和IL-1是膿毒癥時(shí)誘發(fā)AKI的主要因子，對(duì)宿主作用廣泛。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，注射LPS后豬腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞TNF-α表達(dá)增加，腎皮質(zhì)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β表達(dá)增加［8］。TNF-α受體缺失的小鼠，在注射LPS后腎小管上皮細(xì)胞凋亡及腎組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，從而避免LPS介導(dǎo)的AKI發(fā)生［9］。Knotek等［10］予野生型鼠腹腔注射可溶性TNF-α受體p55，1h后再注射LPS，預(yù)處理組腎小球?yàn)V過(guò)率下降幅度低于對(duì)照組(30%vs 70%)，即中和TNF-α可保護(hù)LPS誘導(dǎo)的野生鼠腎功能損傷。TNF-α及IL-1導(dǎo)致AKI發(fā)生的機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放，放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng);表達(dá)組織因子促進(jìn)局部血栓形成;誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡;增加活性氧產(chǎn)生導(dǎo)致局部氧化應(yīng)激等［11，12］。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)調(diào)控TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)，影響膿毒癥的發(fā)展［13］。因此，對(duì)TLR4的研究越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，研究阻斷或抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物也是目前研究熱點(diǎn)。

圖1 簡(jiǎn)化的膿毒癥病理生理過(guò)程［6］

TLR4通路與炎癥因子調(diào)控

TLRs是一類模式識(shí)別受體家族，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)導(dǎo)致炎癥因子的釋放，從而在識(shí)別病原微生物、啟動(dòng)炎癥應(yīng)答中起重要作用。TLR4是TLRs家族成員之一，是識(shí)別革蘭陰性菌細(xì)胞外壁LPS成分的主要受體。在LPS誘導(dǎo)的AKI中發(fā)揮重要作用，通過(guò)阻斷TLR4信號(hào)通路可帶來(lái)膿毒癥AKI治療新手段(圖2)［14］。

圖2 TLR4 信號(hào)通路［14］

TLR4結(jié)構(gòu) TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三個(gè)部分組成。胞外區(qū)由24個(gè)亮氨酸重復(fù)(LRR)序列組成，整個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域呈馬蹄形。胞內(nèi)區(qū)則存在一段序列保守區(qū)，含有大約200個(gè)氨基酸殘基，由Toll同源結(jié)構(gòu)域和分子羧基端長(zhǎng)短不同的短尾肽(0～22個(gè)氨基酸)組成。該序列與IL-1受體胞內(nèi)區(qū)保守序列具有高度的同源性，稱為Toll樣受體/IL-1同源結(jié)構(gòu)域(TIR)。

TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外部分 TLR4主要識(shí)別LPS及具有類脂A結(jié)構(gòu)的衍生物。首先內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(LBP)將LPS從細(xì)菌外膜上轉(zhuǎn)移下來(lái)，并與其脂質(zhì)A結(jié)合，形成LPS-LBP復(fù)合物。然后將復(fù)合物中的LPS傳遞給膜結(jié)合CD14(mCD14)，再由mCD14將LPS傳遞給TLR4。在髓樣分化蛋白2(MD-2)的協(xié)同作用下，LPS激活TLR4并觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)部分

髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 TLR4與配體結(jié)合后促使其本身二聚體化，并使胞內(nèi)區(qū)的TIR區(qū)域構(gòu)象發(fā)生變化。MyD88羧基端與TIR區(qū)域結(jié)合，氨基端的死亡片段可與IL-1相關(guān)蛋白激酶(IRAK)結(jié)合，導(dǎo)致IRAK發(fā)生自身磷酸化。磷酸化的IRAK與胞質(zhì)內(nèi)的TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)結(jié)合，介導(dǎo)兩種不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。一條通路通過(guò)激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子活化激酶1(TAK1)提高核因子抑制蛋白(IκB)激酶復(fù)合物活性(IKK)，作用于IκB使之磷酸化、泛素化最終被降解從而活化核因子 κB(NF-κB)。NF-κB 轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核其活性二聚體可啟動(dòng) TNF-α、IL-6、IL-8和IL-12p40等炎癥介質(zhì)釋放。另一通路則通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，包括cjun氨基末端激酶、p38和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，最終活化轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(AP-1)，而AP-1有刺激細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)化和死亡的作用。

MyD88非依賴性信號(hào)途徑 主要通過(guò)Toll樣受體相關(guān)的干擾活化子(TRIF)相關(guān)接頭蛋白分子(TRAM)引起NF-κB遲發(fā)激活和干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)激活?；罨疘RF-3誘導(dǎo)包括β干擾素在內(nèi)的一系列基因的轉(zhuǎn)錄，如可誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)蛋白10、糖皮質(zhì)激素衰減反應(yīng)基因16、干擾素調(diào)節(jié)基因1表達(dá)和樹突狀細(xì)胞的成熟。

TLR4信號(hào)通路與膿毒癥炎癥因子調(diào)控 LPS與巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞表面TLR4結(jié)合后，通過(guò)MyD88依賴性或非依賴性反應(yīng)通路激活NF-κB。NF-κB進(jìn)入胞核調(diào)控產(chǎn)生一系列前炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-1，繼而產(chǎn)生大量繼發(fā)性炎癥介質(zhì)如IL-6、IL-8;同時(shí)調(diào)控CD80、CD86等輔助刺激因子表達(dá)，在輔助刺激因子幫助下，初始T細(xì)胞分化為Th1和Th2誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫［15］。TLR4胞內(nèi)信號(hào)通路產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)可進(jìn)一步激活NF-κB，形成正反饋的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)度的炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)生SIRS，最終導(dǎo)致膿毒癥及多臟器功能障礙綜合征。

TLR4信號(hào)通路與膿毒癥性AKI

TLR4不僅表達(dá)于固有免疫細(xì)胞(如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞)表面，也在腎臟遠(yuǎn)曲和近曲小管上皮細(xì)胞、包曼囊上皮細(xì)胞及腎血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)［16］。大量研究顯示TLR4在膿毒癥發(fā)病中的重要性，但TLR4與膿毒癥性AKI的相關(guān)研究卻不多。盲腸結(jié)扎穿孔可誘發(fā)多種微生物感染而導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生，在該動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn)TLR4在近曲小管及遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞、腎小球、腎血管表達(dá)顯著增加［17］。C3H/HeJ小鼠由于 TLR4基因第3個(gè)外顯子發(fā)生了點(diǎn)突變，導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)多肽鏈第712位組氨酸由脯氨酸代替，從而改變了TLR4信號(hào)通路。注射0.25mg LPS后24h監(jiān)測(cè)血尿素氮水平，未發(fā)現(xiàn) C3H/HeJ小鼠有 AKI征象，在注射LPS 2h后C3H/HeJ小鼠外周血也未檢出TNF-α，且腎組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及腎臟細(xì)胞凋亡更罕見［18］。

以上研究支持TLR4參與膿毒癥性AKI的發(fā)生，而TLR4在腎臟細(xì)胞及腎外細(xì)胞均有表達(dá)，El-Achkar等［19］認(rèn)為內(nèi)毒素通過(guò)兩種途徑造成腎小管上皮細(xì)胞及腎血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。除了與固有免疫細(xì)胞TLR4結(jié)合后釋放系統(tǒng)性炎癥因子間接作用于腎臟引起損傷，還可作用于腎小管上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞TLR4，引起局部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，直接造成腎臟損傷。Cunningham等［18］認(rèn)為腎外 TLR4在內(nèi)毒素誘導(dǎo)腎臟損傷中起主要作用，而腎臟TLR4僅在LPS誘導(dǎo)的TNF-α介導(dǎo)的腎小管及血管細(xì)胞凋亡發(fā)揮較小的作用。該研究將C3H/HeJ小鼠腎臟交叉移植給野生型小鼠后，小鼠血尿素氮水平升高明顯，而將野生型小鼠腎臟移植給C3H/HeJ小鼠后，小鼠雖然出現(xiàn)血尿素氮水平升高，但較升高幅度明顯低于前者，可抵抗LPS誘導(dǎo)腎臟損傷。

阻斷TLR4通路治療膿毒癥AKI

瑞沙托維(TAK-242) TAK-242化學(xué)名稱(6R)-6-［(2-氯-4-氟苯基)胺］磺?；?1-環(huán)己烷-1-羧酸乙酯，分子式 C15H17CIFNO4S，分子量361.82。TAK-242是小分子TLR4信號(hào)通路抑制劑，可直接與TLR4胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域TIR半胱氨酸(Cys)747結(jié)合，抑制TIR與其接頭蛋白如Toll/IL-1受體銜接蛋白(TIRAP/Mal)、TRAM結(jié)合，從而阻斷TIRAP介導(dǎo)的NF-κB及TRAM 介導(dǎo)的NF-κB、干擾素等激活，最終抑制 NO、TNF-α、IL-6等多種細(xì)胞因子產(chǎn)生［20-22］。

Fenhammar等［23］通過(guò)隨機(jī)對(duì)照研究，首次探討了TAK-242對(duì)膿毒癥時(shí)腎功能的保護(hù)作用。因人類的TLR4與羊相似，故該作者選擇20只成年特克塞爾雜交羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)24h持續(xù)注射LPS［3μg/(kg·h)］誘導(dǎo)膿毒癥模型。實(shí)驗(yàn)組首先靜脈推注2mg/kg TAK-242，后續(xù) 4mg/(kg·d)維持。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射LPS后動(dòng)物出現(xiàn)低血壓，心動(dòng)過(guò)速，心臟指數(shù)下降，同時(shí)出現(xiàn)尿量及肌酐清除率下降，血肌酐、尿素氮、乳酸鹽水平升高。與對(duì)照組相比，TAK-242顯著改善血壓，尿量和肌酐清除率，同時(shí)血肌酐、尿素氮、乳酸鹽水平及尿NAG水平顯著下降。該研究表明在出現(xiàn)AKI前使用TAK-242可減輕LPS誘導(dǎo)的羊腎臟損傷。同時(shí)提出需更進(jìn)一步研究TLR4激活后導(dǎo)致AKI的完整機(jī)制，及TLR4抑制劑是否能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)存在的AKI，阻斷TLR4信號(hào)是否能有效保護(hù)細(xì)菌感染導(dǎo)致的AKI。

在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，健康受試者注射TAK-242可抑制TNF-α、IL-1和IL-6產(chǎn)生，伴發(fā)輕度溶血及高鐵血紅蛋白血癥，但無(wú)臨床意義［24］。近期 Rice等［25］進(jìn)行了隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)，其目的在于確定TAK-242降低細(xì)胞因子的最佳給藥方案，評(píng)估藥物療效及安全性。共納入93個(gè)重癥監(jiān)護(hù)中心274例嚴(yán)重膿毒癥、休克或呼吸衰竭患者，分為安慰劑組、低劑量 TAK-242 組［1.2mg/(kg·d)］、高劑量TAK-242組［2.4mg/(kg·d)］。遺憾的是，該研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論低劑量組還是高劑量組均未抑制IL-6水平;28d全因死亡率高劑量組低于安慰劑組(17.4%vs 24.2%;P=0.26)，但低劑量組與安慰劑組類似(22.0%vs 24.2%;P=0.73)。該研究結(jié)果表明TAK-242治療耐受性良好，但未能顯著提高生存率。由于研究第一階段觀察到IL-6水平無(wú)明顯下降即停止納入患者，研究對(duì)象數(shù)量相對(duì)較少，因此TAK-242能否改善人類的生存率尚無(wú)明確結(jié)論。未來(lái)需要大樣本、前瞻、隨機(jī)臨床試驗(yàn)確定TAK-242是否確實(shí)能提高膿毒性休克和呼吸衰竭患者的死亡率［25］。

依立托侖四鈉(E5564)E5564化學(xué)名稱3-O-癸基-2-脫氧-6-O-［2-脫氧-3-O-［(3R)-3-甲氧基癸基］-6-O-甲基-2-［(11Z)-1-氧代-11-十八烯基］氨基-4-O-磷?；?β-D-吡喃葡萄糖］-2-［(1，3-二氧代十四烷基)氨基］-α-D-吡喃葡萄糖 1-(二氫磷酸)，分子式:C66H122N2O19P2.4Na，分子量1 401.59。LPS 由脂質(zhì)A、核心多糖和O抗原三部分組成，其中脂質(zhì)A為主要毒性成分，結(jié)構(gòu)保守。E5564是人工合成類球紅桿菌LPS脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)類似物，直接與MD-2的疏水口袋結(jié)合，與脂質(zhì)A競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合同一位點(diǎn)，從而防止TLR4二聚體形成和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［26，27］。

研究表明TLR4參與并介導(dǎo)腎臟缺血再灌注損傷(RIRI)過(guò)程［28］。Liu等［29］建立 SD 大鼠 RIRI模型予E5564治療，而對(duì)照組給予生理鹽水治療，觀察各組的腎功能情況、腎組織光鏡病理，并測(cè)定檢測(cè)腎組織炎癥因子趨化因子的表達(dá)。結(jié)果E5564可有效地抑制中多種炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表達(dá)，減輕腎組織的損傷程度。與RIRI類似，TLR4參與膿毒癥條件下AKI的炎癥反應(yīng)，因此E5564同樣可以減輕膿毒癥腎臟損傷。

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，E5564可抑制LPS刺激的人類、小鼠、大鼠、豚鼠來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞等，多種細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1β、TNF-α、IL-6 和 IL-8等細(xì)胞因子［30］。

Ⅰ期臨床試驗(yàn)已證實(shí)E5564的安全性和耐受性［31］。一項(xiàng)前瞻隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照的多中心，劑量增加的Ⅱ期臨床試驗(yàn)，觀察E5564是否降低嚴(yán)重膿毒癥患者28d死亡率。共納入300例患者，分安慰劑組，低劑量組(45mg，2次/d，共6d)，高劑量組(105mg，2次/d，共6d)。三組膿毒癥患者合并急性腎損傷比率分別為 21.9%，17.5%，20.2%。研究發(fā)現(xiàn)在APACHEⅡ評(píng)分高的危重患者高劑量治療組死亡率低于安慰劑組(33.3%vs 56.3%，P=0.105)，表明E5564具有較好耐受性，在嚴(yán)重膿毒癥患者及預(yù)測(cè)高死亡率患者，高劑量E5564可降低死亡率［32］。一項(xiàng)關(guān)于國(guó)際性多中心嚴(yán)重膿毒癥患者靜脈注射105mg E5564的臨床Ⅲ期研究已經(jīng)結(jié)束，其結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)正在進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析中(NCT00334828)。

小結(jié):TLR4在膿毒癥性AKI中發(fā)揮了重要的致病作用，TLR4信號(hào)通路可成為膿毒癥性AKI治療的新靶點(diǎn)。目前TLR4阻斷劑治療膿毒癥已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，但是這些研究并未顯著改善患者的生存率，尚有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本以證實(shí)其用法和臨床療效。

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