促紅細(xì)胞生成素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)小鼠急性腎損傷的作用機(jī)制

劉楠梅 田 軍 韓國鋒 程 勁 黃 健 張金元

急性腎損傷(AKI)是臨床常見病，尚無特異性治療方法可以阻止其疾病進(jìn)展。隨著干細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展，為腎臟疾病的治療研究提供了新的途徑。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)是骨髓中一大類具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞，研究表明BM-MSCs移植是一種很有潛力的AKI治療方法，歸巢至腎臟的BM-MSCs可通過其分化及旁分泌功能促進(jìn)AKI的修復(fù)［1-3］，但其改善能力有限，移植細(xì)胞向損傷腎臟的歸巢數(shù)量有限是影響修復(fù)效率的原因之一。在BM-MSCs的定向歸巢機(jī)制中，目前研究較多的是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)/CXCR4軸［4］。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種能調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞生長分化的糖蛋白，其治療AKI的有效性已被廣泛證明［5-7］，但尚無相關(guān)研究表明這種藥物是否會(huì)對(duì)BM-MSCs移植的定向腎臟歸巢有益，從而增強(qiáng)移植治療效果。本實(shí)驗(yàn)即構(gòu)建缺血再灌注(I/R)誘導(dǎo)的AKI小鼠模型，行BM-MSCs移植，觀察外源性EPO干預(yù)對(duì)移植BM-MSCs的AKI修復(fù)效應(yīng)的影響，并探討其可能機(jī)制。

材料與方法

動(dòng)物與試劑 實(shí)驗(yàn)用C57BL/6小鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0003］，實(shí)驗(yàn)在第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成［動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(滬)2007-0003］。C57BL/6小鼠BM-MSCs細(xì)胞株購自ATCC公司，5溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)及BrdU單克隆抗體購自Sigma公司，SDF-1單克隆抗體購自Santa Cruz公司，免疫組化檢測試劑盒購自Jackson公司。

BM-MSCs的BrdU標(biāo)記 大量傳代BM-MSCs細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底60%(即達(dá)對(duì)數(shù)生長期)時(shí)，傾去DMEM培養(yǎng)液，加入含10μmol/L BrdU標(biāo)記液的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育72h，免疫組化法對(duì)BrdU標(biāo)記率進(jìn)行鑒定。標(biāo)記好的BM-MSCs備用。

小鼠AKI模型的制備、實(shí)驗(yàn)分組及處理 選取體重(20±2)g的C57BL/6小鼠100只，預(yù)養(yǎng)3d，隨機(jī)分為5組，每組20只，2%戊巴比妥鈉溶液(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正常對(duì)照組:麻醉后暴露腎臟30 min關(guān)閉，尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml;模型組(AKI組):麻醉后夾閉雙側(cè)腎蒂30 min后開放，關(guān)閉腹腔，建立AKI模型，尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml;BM-MSCs移植組:AKI建模后尾靜脈注射0.2 ml含有2×106個(gè)BrdU-BM-MSCs的PBS液;EPO干預(yù)組:AKI建模后予3 000 U/kg EPO皮下注射3d;EPO干預(yù)+BM-MSCs移植組:AKI建模后尾靜脈注射0.2 ml含有2 ×106個(gè) BrdU-BM-MSCs的 PBS液，同時(shí)予3 000 U/kg EPO皮下注射3d。各組小鼠均在溫度、濕度適宜的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。分別于建模后 1d、3d、7d、14d處死部分小鼠(每次每組均處死5只)，摘眼球取血，分離血清后-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.01 mmol/L PBS液100 ml經(jīng)心臟沖洗血液后取雙側(cè)腎臟，再用上述濃度的PBS液對(duì)獲取的腎臟進(jìn)行沖洗，10%甲醛固定備作病理及免疫組化等檢查。

血液指標(biāo) 收集的血清采用Beckman自動(dòng)生化儀檢測尿素氮(BUN)及血清肌酐(SCr)。

病理改變 石蠟切片，HE染色后對(duì)腎小管壞死程度進(jìn)行評(píng)分(盲法):每張切片200倍鏡下取15個(gè)視野，0=正常、1=輕微損傷(受損腎小管 ＜5%)、2=輕度損傷(受損腎小管5%～25%)、3=中度損傷(受損腎小管26%～75%)、4=重度損傷(受損腎小管＞75%)，半定量分析并計(jì)算其均值，作為腎小管壞死的評(píng)分指數(shù)(ATN評(píng)分)。

免疫組化法檢測BrdU表達(dá) 10%中性甲醛溶液固定24h，常規(guī)石蠟包埋。切片置于二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，0.3%H2O2室溫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，加抗原修復(fù)液，微波加熱暴露抗原(98℃，3 min)。切片與BrdU單克隆抗體4℃孵育16h。PBS液洗片后加辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記抗小鼠IgG，37℃孵育1h，洗片后加DAB底物顯色液15 min，蘇木素襯染，常規(guī)樹脂封片，室溫保存。測量方法:每份標(biāo)本分別選取15個(gè)髓質(zhì)部非重疊視野(×200倍)，計(jì)數(shù)腎小管上皮組織中BrdU+細(xì)胞所占百分比，取其均數(shù)納入統(tǒng)計(jì)。

Western印跡法檢測腎組織SDF-1水平 腎組織80～100mg加入1 ml三去污裂解液，4℃ 20 000 r/min離心10 min，取上清再次4℃ 12 000 r/min離心10 min，測蛋白濃度，取25μg蛋白進(jìn)行 SDSPAGE電泳。蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，含1%BSA的TBST 為封閉液(10 mmol/l Tris-HCl，pH 7.14，150 mmol/L NaCl，1%Tween-20)，室溫封閉 4h，加入SDF-1單抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌液洗膜3次×15 min，加入HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗，室溫?fù)u動(dòng)1h，洗膜3次×15 min，置于柯達(dá)活體成像儀中觀察結(jié)果，曝光3 min，CCD自動(dòng)獲取圖片結(jié)果。測量條帶的灰度值，β-actin為內(nèi)參，各蛋白的表達(dá)強(qiáng)度為兩者灰度的比值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素的方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

BM-MSCs的BrdU標(biāo)記 本實(shí)驗(yàn)采用BrdU標(biāo)記液對(duì)BM-MSCs標(biāo)記，該方法簡便易行，標(biāo)記陽性率高，經(jīng)免疫組化證實(shí)陽性為BrdU環(huán)細(xì)胞核周呈棕色分布(圖1)，半定量分析證實(shí)其標(biāo)記陽性率達(dá)98.71% ±0.32%。

BUN、SCr及ATN評(píng)分情況 與正常對(duì)照組比，AKI組小鼠的BUN、SCr及ATN評(píng)分于術(shù)后顯著升高，以建模后第1d達(dá)到最高峰(P＜0.01)，此后有降低趨勢(圖2～4)。

BM-MSCs移植后，AKI小鼠 BUN、SCr、ATN 評(píng)分有不同程度降低，與AKI組相比，以移植后第3d及第7d差異最為顯著(P＜0.05)，但與同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組相比，其BUN、SCr水平仍顯著升高，且隨著移植時(shí)間延長，BUN、SCr及ATN評(píng)分下降趨勢逐漸減弱(圖2～4)。

EPO干預(yù)也同樣可以輕度降低 AKI小鼠的BUN、SCr水平及ATN評(píng)分，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在BM-MSCs移植的基礎(chǔ)上聯(lián)合EPO干預(yù)，AKI小鼠的BUN、SCr以及ATN評(píng)分則有更為顯著地降低(P ＜0.05或 P ＜0.01);與單純 BM-MSCs移植組比，該組小鼠建模后第7d、第14d的BUN、SCr及ATN評(píng)分降低更為顯著(P＜0.05或P＜0.01);亦顯著低于同時(shí)間點(diǎn)的EPO干預(yù)組;且隨著移植時(shí)間的延長，BUN、SCr及ATN評(píng)分下降趨勢并未減弱，至建模后第14d小鼠的BUN、SCr水平甚至接近正常對(duì)照組(圖2～4)。

腎小管組織病理變化 HE染色見模型鼠腎小管上皮細(xì)胞(RTECs)空泡變性、刷狀緣脫落明顯，部分腎小管基膜裸露形成裸膜，管腔中可見脫落的RTECs，以建模后第1天最嚴(yán)重，隨著建模時(shí)間延長AKI組小鼠的腎小管損傷有一定的自身修復(fù)。BM-MSCs移植組及EPO干預(yù)組于腎髓質(zhì)中均可見胞核深染、胞體較大的再生RTECs。在BM-MSCs移植的基礎(chǔ)上聯(lián)合EPO干預(yù)，較同時(shí)間點(diǎn)BM-MSCs移植組和EPO干預(yù)組比，其腎小管損傷的修復(fù)顯著加快。

圖2 各組小鼠血尿素氮(BUN)水平

圖3 各組小鼠血清肌酐(SCr)水平

圖4 各組小鼠ATN評(píng)分

BM-MSCs在腎組織的分布 光鏡下細(xì)胞核呈棕褐色為BrdU+細(xì)胞，免疫組化染色時(shí)，正常對(duì)照組、AKI組、EPO干預(yù)組小鼠腎小管上皮組織的細(xì)胞核均呈藍(lán)色，但BM-MSCs移植組小鼠腎小管上皮組織中，有部分細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色，以建模后第7天最多，其占RTECs的比例為11.32% ±1.38%。在BM-MSCs移植的基礎(chǔ)上聯(lián)合EPO干預(yù)，可增加腎小管上皮組織中BrdU+細(xì)胞的比例，以建模后第3d、第7d差異最為顯著(P ＜0.05或 P ＜0.01)(圖5、6)。

圖5 兩組小鼠BrdU+細(xì)胞分布(IH，×100:細(xì)胞核呈棕褐色為陽性)

腎組織中SDF-1的表達(dá) Western印跡檢測表明，建模后腎組織中SDF-1水平顯著升高(P＜0.01)，于建模后第7天達(dá)高峰(圖7)。選第7天為觀察時(shí)間點(diǎn)，與AKI組比，BM-MSCs移植組腎組織中SDF-1表達(dá)無明顯差異，而外源性EPO可增加SDF-1的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中EPO干預(yù)組及EPO干預(yù)+BMMSCs移植組的SDF-1水平均顯著升高(P＜0.01)，但這兩組之間的SDF-1表達(dá)差異無顯著性(圖8)。

圖6 兩組小鼠的Brd U+細(xì)胞百分比

討 論

AKI的干細(xì)胞移植是一種新興的細(xì)胞生物工程技術(shù)，BM-MSCs是比較理想的移植用“種子細(xì)胞”，許多研究均已證實(shí)BM-MSCs的這一功效，但研究也同時(shí)觀察到單純BM-MSCs移植的腎臟修復(fù)能力是非常有限，從而限制了其臨床推廣應(yīng)用。本研究也觀察到AKI小鼠經(jīng)BM-MSCs移植后其BUN、SCr值及ATN評(píng)分雖均降低，但仍顯著高于正常對(duì)照組，且隨著移植時(shí)間延長，上述指標(biāo)的下降趨勢逐漸減弱。移植細(xì)胞向靶器官的歸巢數(shù)量有限以及AKI微環(huán)境不利于歸巢干細(xì)胞的存活是目前備受關(guān)注的兩大原因。

圖7 對(duì)照組及模型組不同時(shí)間點(diǎn)腎組織中SDF-1的表達(dá)

圖8 建模7d后各組小鼠腎組織中SDF-1的表達(dá)

目前認(rèn)為，EPO不但是紅細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)因子，而且還可通過EPO受體(EPOR)對(duì)多種非造血細(xì)胞及組織發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。前期我們已經(jīng)通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)BM-MSCs表達(dá)EPOR，EPO可通過EPOR減輕體外模擬AKI微環(huán)境下培養(yǎng)BM-MSCs的凋亡，促進(jìn)其增生，從而減輕AKI微環(huán)境對(duì)歸巢干細(xì)胞存活的不利影響［8］。那么 EPO對(duì)移植BM-MSCs的腎向歸巢是否同樣具有有利地靶向調(diào)控作用呢?

SDF-1/CXCR4軸在調(diào)控干細(xì)胞遷移/歸巢方面發(fā)揮重要作用［4］。SDF-1 是 1994 年Nagasawa等［9］在小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞pA6分泌的細(xì)胞因子中發(fā)現(xiàn)的，已有報(bào)道證明其能組成性地在大腦、心、腎、肝、肺和脾中廣泛表達(dá)［10］，缺血微環(huán)境將上調(diào)其表達(dá)［11，12］，本研究中觀察到模型小鼠腎組織中 SDF-1水平升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［13］。SDF-1的受體CXCR4，是一個(gè)有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)受體，其結(jié)構(gòu)高度保守，在人體內(nèi)編碼基因位于第4號(hào)染色體。文獻(xiàn)報(bào)道，BM-MSCs可表達(dá) CXCR4［14］，SDF-1對(duì)表達(dá)CXCR4的BM-MSCs具有強(qiáng)大的化學(xué)吸引作用，其與CXCR4的特異結(jié)合有利于BM-MSCs的定向趨化。增強(qiáng)受損腎組織SDF-1的表達(dá)，將有助吸引移植干細(xì)胞的腎臟歸巢。

已有文獻(xiàn)報(bào)道EPO干預(yù)可增強(qiáng)急性心肌梗塞模型大鼠缺血組織中 SDF-1的表達(dá)［15，16］。本研究中移植組與 AKI組 SDF-1水平無差異，表明BM-MSCs移植本身對(duì)腎組織SDF-1表達(dá)無影響，但在移植基礎(chǔ)上結(jié)合EPO皮下注射，可見SDF-1蛋白水平顯著升高，且與單純EPO干預(yù)組相比無顯著差異，文獻(xiàn)報(bào)道EPO可能是通過EPOR增強(qiáng)損傷組織中 SDF-1的分泌［17］。這將有助增強(qiáng)對(duì)表達(dá)有CXCR4的移植BM-MSCs的定向趨化。

既然EPO可以促進(jìn)移植BM-MSCs的腎向歸巢，那么在植入有限數(shù)量BM-MSCs治療AKI時(shí)，聯(lián)合EPO干預(yù)，勢必可以增加腎臟中移植細(xì)胞的數(shù)量，從而有更多BM-MSCs通過分化及旁分泌作用發(fā)揮促進(jìn)腎臟修復(fù)效能［18，19］。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一推測，BM-MSCs移植+EPO干預(yù)組小鼠腎小管上皮組織中BrdU+細(xì)胞的比例顯著高于單純BM-MSCs移植組，部分時(shí)間點(diǎn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但有趣的是術(shù)后第14d EPO干預(yù) +BM-MSCs移植組BrdU+細(xì)胞百分比反而降低，我們推測這是因?yàn)殡S著移植時(shí)間延長，移植細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)導(dǎo)致自身修復(fù)的RTECs增多，使得百分比減小。

因此，我們認(rèn)為在BM-MSCs移植治療AKI時(shí)，聯(lián)合EPO干預(yù)將放大其移植修復(fù)效果。我們的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，單純BM-MSCs移植組移植后第3d，小鼠BUN、SCr及ATN評(píng)分顯著低于AKI組，但隨移植時(shí)間延長，下降趨勢逐漸減弱;但EPO干預(yù)+BM-MSCs移植組在移植后第3d起的各時(shí)間點(diǎn)BUN、SCr及ATN評(píng)分均顯著低于AKI組小鼠。隨著移植時(shí)間延長，聯(lián)合治療組小鼠的BUN、SCr水平及ATN評(píng)分均顯著低于單純BM-MSCs移植組及EPO干預(yù)組，其對(duì)腎臟修復(fù)效應(yīng)并非BM-MSCs移植及EPO干預(yù)兩者作用的簡單疊加。

綜上，我們認(rèn)為聯(lián)合EPO注射和BM-MSCs移植可能是治療AKI一種新的有效手段，加速推動(dòng)BM-MSCs移植在臨床的應(yīng)用。

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