海洋真菌Fusarium sp.次級代謝產(chǎn)物的研究

劉 濤，李占林，王 宇，田 黎，裴月湖，華會明

1中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110001;2沈陽藥科大學(xué)創(chuàng)新藥物研究與設(shè)計教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110016; 3國家海洋局第一海洋研究所，青島266061;4青島科技大學(xué)，青島266042

海洋真菌Fusarium sp.次級代謝產(chǎn)物的研究

劉 濤1*，李占林2，王 宇2，田 黎3，4，裴月湖2，華會明2

1中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110001;2沈陽藥科大學(xué)創(chuàng)新藥物研究與設(shè)計教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110016;3國家海洋局第一海洋研究所，青島266061;4青島科技大學(xué)，青島266042

采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜、開放ODS柱色譜以及HPLC等方法從海洋真菌Fusarium sp.的菌絲體中分離得到5個化合物，通過波譜數(shù)據(jù)及理化性質(zhì)分別鑒定為3β，15β-二羥基-(22E，24R)-麥角甾-5，8(14)，22-三烯-7-酮(1)、3β，5α，9α-三羥基-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-6-酮(2)、(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇(3)、5α，8α-過氧-(22E，24R)-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇(4)和丁二酸(5)。其中化合物1和2首次從該屬真菌中分離得到。

海洋真菌;鐮孢霉屬真菌;次級代謝產(chǎn)物;麥角甾醇

海洋生物總量約占地球生物總量的87%，是一個巨大的生物資源寶庫。海洋獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境造就了其生物的生存及代謝方式的特殊性［1］。

美國國立腫瘤研究所(NCI)，自1986年起將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向?qū)Ｑ笳婢?、藍(lán)細(xì)菌以及其它各類型海洋微生物的研究。其研究結(jié)果表明，海洋微生物在抗腫瘤藥物方面具有巨大的開發(fā)價值。近些年來，隨著對海洋微生物次級代謝產(chǎn)物研究的不斷深入，從海洋真菌中發(fā)現(xiàn)了越來越多的抗癌活性物質(zhì)，而且它們往往具有新穎的結(jié)構(gòu)。海洋真菌次級代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為了一個熱點(diǎn)的研究領(lǐng)域。

鐮孢霉屬(Fusarium)又名鐮刀菌屬，為半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲孢綱(Hyphomycetes)，瘤座孢目(Tuberculariales)中的一個屬，是重要的真菌類群。陸生鐮孢霉屬真菌是一種常見的植物病原菌［2］。近年來，從海洋來源的鐮孢霉屬真菌中相繼發(fā)現(xiàn)了環(huán)肽、神經(jīng)鞘胺醇苷、蒽醌及甾體衍生物等許多結(jié)構(gòu)獨(dú)特，活性顯著的次生代謝產(chǎn)物，引起了人們的廣泛關(guān)注。為了尋找新的抗癌活性成分，作者對海洋來源鐮孢霉屬真菌Fusarium sp.菌絲體的丙酮提取物進(jìn)行了化學(xué)成分研究，從中分離得到5個化合物，通過1D和2D NMR以及文獻(xiàn)對照等手段鑒定了這些化合物的結(jié)構(gòu)。

1 儀器與材料

Bruker ARX-300和AV-600型核磁共振儀;日本HITACHI公司L 2130型HPLC，檢測器為HITACHI L 2400型;YMC-Pack ODS-AM:10 mm×250 mm;開放ODS柱色譜填料(100 μm，日本YMC公司);Sephadex LH-20為GEhealthcare產(chǎn)品;柱色譜硅膠(200～300目)及薄層色譜硅膠均購于青島海洋化工廠。所有試劑為分析純和色譜純。

海洋鐮孢霉屬真菌Fusarium sp.于2007年4月分離自南海潮間帶紅樹植物正紅樹(Rhizophora apiculata)根際泥，由國家海洋局第一海洋研究所，青島科技大學(xué)田黎教授鑒定。菌株編號:HTTM-Z07006，存放于科技部資助的國家海洋局第一海洋研究所藥用海洋微生物菌種資源庫。

發(fā)酵培養(yǎng)基及條件:馬鈴薯浸汁200 mL，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，葡萄糖17 g，NaCl 15 g，MgCl2· 6H2O 1 g，KCl 0.1 g，F(xiàn)ePO40.01 g，水1000 mL，24℃，150 rpm，振蕩培養(yǎng)12 d，發(fā)酵量60 L。

2 提取分離

發(fā)酵液60 L，經(jīng)多層紗布過濾，分離得到濾液和菌絲體。菌絲體(濕重1906.5 g)經(jīng)反復(fù)“冷凍-融化”處理后，用4倍量丙酮超聲提取三次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏81.5 g。浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用氯仿-甲醇(100∶0～0∶100)進(jìn)行梯度洗脫，得到282個流份(500 mL/流份)。第33～55流份合并，經(jīng) Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，第6-15亞流份合并，經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-丙酮(50∶1～7∶2)進(jìn)行梯度洗脫，得到化合物4(6 mg);第51-57流份合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，第17-19亞流份合并，經(jīng)開放ODS柱色譜及Sephadex LH-20柱色譜得到化合物1(2 mg);第85～95流份合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，第11～14亞流份合并，經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，所得流份再經(jīng)過Sephadex LH-20(甲醇洗脫)，HPLC(體積分?jǐn)?shù)30%的甲醇水溶液為流動相，保留時間為75 min)以及開放ODS柱色譜(體積分?jǐn)?shù)為30%～75%的甲醇水溶液梯度洗脫)得到化合物2(2 mg);第96-123流份合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，第12～16亞流份合并，經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿-甲醇(9∶1，5∶1)梯度洗脫，得到化合物3(3 mg);第124-135流份合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，第16～19亞流份合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，得到化合物5(7 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無色針狀結(jié)晶(甲醇)，1H NMR(300 MHz，C5D5N)給出δ 1.09(3H，d，J=6.6 Hz)，1.00 (3H，s)，0.95(3H，s)，0.92(3H，d，J=6.8 Hz)，0.85(3H，d，J=6.8 Hz)，0.84(3H，d，J=6.8 Hz)六個甲基質(zhì)子信號，結(jié)合13C NMR(150 MHz，C5D5N)給出28個碳信號，推測該化合物為麥角甾類。δ 5.30(1H，dd，J=15.2，7.9 Hz)，5.28(1H，dd，J=15.2，7.9 Hz)為側(cè)鏈22，23位反式雙鍵相互偶合的特征質(zhì)子信號。δ 6.04(1H，d，J=1.8 Hz)為一烯氫質(zhì)子信號，結(jié)合碳譜給出的7個碳信號(δ 191.7，171.5，169.6，135.1，132.8，128.7，127.0)，推測結(jié)構(gòu)中含有三個碳碳雙鍵(其中三個為季碳)以及一個羰基，且兩個雙鍵與羰基形成共軛體系。氫譜給出δ 4.98(1H，br s)，3.88(1H，m)兩個連氧碳上質(zhì)子信號，結(jié)合碳譜中δ 70.3，69.6兩個連氧碳信號，推測結(jié)構(gòu)中應(yīng)該有兩個羥基取代。HMBC進(jìn)一步給出H-15(δH4.98，1H，br s)與C-13(δC45.9)，C-17(δC53.7)，C-8(δC128.7)的遠(yuǎn)程相關(guān); H-18(δH0.95，3H，s)與C-14(δC169.6)的遠(yuǎn)程相關(guān)，可以確定15-OH及△8(14)的取代位置。根據(jù)H-6(δH6.04，1H，d)與 C-10(δC40.1)，C-4(δC42.7)，C-8(δC128.7)存在遠(yuǎn)程相關(guān)以及H-19(δH1.00，3H，s)與C-5(δC171.5)存在遠(yuǎn)程相關(guān)，可確定△5(6)的取代位置。根據(jù)△5(6)，△8(14)四個雙鍵碳的化學(xué)位移值，推測結(jié)構(gòu)中存在兩對α，β-不飽和羰基，因此羰基碳應(yīng)在C-7位。采用CDCl3重新測試該化合物的1H NMR，H-15化學(xué)位移值為δ 4.70(d，J=5.4 Hz)，15-OH化學(xué)位移值為5.66，與文獻(xiàn)［3］對照確定15位羥基為β構(gòu)型。根據(jù)以上信息并結(jié)合文獻(xiàn)［3］，確定該化合物結(jié)構(gòu)為3β，15β-二羥基-(22E，24R)-麥角甾-5，8(14)，22-三烯-7-酮［3β，15β-dihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-5，8(14)，22-triene-7-one］。具體 NMR數(shù)據(jù)歸屬如下:1H NMR(300 MHz，C5D5N)δ:6.04(1H，d，J=1.8 Hz， H-6)，5.30(1H，dd，J=15.2，7.9 Hz，H-22)，5.28 (1H，dd，J=15.2，7.9 Hz，H-23)，4.98(1H，br s，H-15)，3.88(1H，m，H-3)，2.82(1H，m，H-4b)，2.69 (1H，m，H-4a)，2.43(1H，m，H-9)，2.18(2H，m，H-16b，20)，2.11(1H，m，H-2b)，2.00(2H，m，H-12b，17)，1.87(1H，m，H-16a)，1.86(1H，m，H-24)，1.78 (1H，m，H-2a)，1.77(1H，m，H-1b)，1.76(2H，m，H-11)，1.45(1H，m，H-25)，1.38(1H，m，H-12a)，1.24 (1H，m，H-1a)，1.09(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，1.00(3H，s，H-19)，0.95(3H，s，H-18)，0.92(3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.84(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)。13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ:191.7(C-7)，171.5(C-5)，169.6(C-14)，135.1(C-22)，132.8(C-23)，128.7(C-8)，127.0(C-6)，70.3(C-15)，69.6(C-3)，53.7(C-17)，47.1(C-9)，45.9(C-13)，43.1(C-24)，42.7(C-4)，40.1(C-10)，38.9(C-20)，37.5(C-16)，35.7(C-12)，35.6 (C-1)，33.3(C-25)，32.0(C-2)，19.4(C-11)，21.8 (C-21)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，19.5(C-18)，18.8(C-19)，17.8(C-28)。

化合物2 白色無定形粉末，1H NMR(300 MHz，C5D5N)δ:8.62(1H，s，5-OH)，6.28(2H，br s，3-OH and 9-OH)，5.93(1H，d，J=2.1 Hz，H-7)，5.27(1H，dd，J=15.3，7.2 Hz，H-23)，5.17(1H，dd，J=15.3，7.2 Hz，H-22)，4.64(1H，m，H-3)，1.15 (3H，s，H-19)，1.04(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.95 (3H，d，J=6.9 Hz，H-28)，0.86(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.85(3H，d，J=6.9 Hz，H-26)，0.63(3H，s，H-18)。13C NMR(75 MHz，C5D5N)δ:199.1(C-6)，164.1(C-8)，135.2(C-22)，132.4(C-23)，120.3 (C-7)，79.8(C-5)，75.0(C-9)，66.8(C-3)，56.1(C-17)，52.0(C-14)，45.3(C-13)，43.1(C-24)，42.2 (C-10)，40.6(C-20)，38.2(C-4)，35.5(C-12)，33.3 (C-25)，31.5(C-2)，29.0(C-11)，28.4(C-16)，26.4(C-1)，22.7(C-15)，21.3(C-21)，20.4(C-19)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，17.9(C-28)，12.4(C-18)。以上數(shù)據(jù)，經(jīng)與文獻(xiàn)［4］對照確定該化合物結(jié)構(gòu)為3β，5α，9α-三羥基-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-6-酮［3β，5α，9α-trihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-6-one］。

化合物3 無色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，1H NMR(300 MHz，C5D5N)δ:5.74(1H，m，H-7)，5.25 (1H，dd，J=15.0，6.9 Hz，H-22)，5.17(1H，dd，J= 15.0，6.9 Hz，H-23)，4.83(1H，m，H-6)，4.32(1H，m，H-3)，1.53(3H，s，H-19)，1.05(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.94(3H，d，J=6.9 Hz，H-28)，0.85 (3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，H-26)，0.65(3H，s，H-18)。13C NMR(75 MHz，C5D5N)δ:141.5(C-8)，136.1(C-22)，132.1(C-23)，120.5(C-7)，76.1(C-5)，74.3(C-6)，67.6(C-3)，56.1(C-17)，55.2(C-14)，43.7(C-9 and C-13)，43.0(C-24)，42.0(C-4)，40.9(C-20)，39.9(C-12)，38.1(C-10)，33.8(C-2)，33.3(C-25)，32.7(C-1)，28.5(C-16)，23.5(C-15)，22.4(C-11)，21.4(C-27)，20.1(C-26)，19.8(C-21)，18.8(C-19)，17.8 (C-28)，12.5(C-18)。以上數(shù)據(jù)，經(jīng)與文獻(xiàn)［5］對照確定該化合物結(jié)構(gòu)為(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇［(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5α，6β-triol］。

化合物4 無色針晶(乙酸乙酯)，1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ:6.50(1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，6.24 (1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，5.20(1H，dd，J=15.5，7.8 Hz，H-22)，5.16(1H，dd，J=15.5，7.8 Hz，H-23)，3.97(1H，m，H-3)，1.00(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.90(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.88(3H，s，H-19)，0.83(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.82(3H，s，H-18)，0.81(3H，d，J=6.6 Hz，H-26)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:135.4(C-22)，135.2(C-6)，132.3(C-23)，130.7(C-7)，82.1(C-5)，79.4(C-8)，66.4(C-3)，56.2(C-17)，51.6(C-14)，51.0(C-9)，44.5(C-13)，42.7(C-24)，39.7(C-20)，39.3(C-12)，36.9 (C-4 and C-10)，34.7(C-1)，33.0(C-25)，30.1(C-2)，28.6(C-16)，23.4(C-11)，20.9(C-21)，20.6(C-15)，19.9(C-27)，19.6(C-26)，18.2(C-19)，17.5 (C-28)，12.8(C-18)。以上數(shù)據(jù)，經(jīng)與文獻(xiàn)［6］中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為5α，8α-過氧-(22E，24R)麥角甾-6，22-二烯-3β-醇［5α，8α-epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-dien-3β-ol］。

化合物5 無色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，溴甲酚綠反應(yīng)陽性。1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ:12.13 (2H，s，COOH)，2.42(4H，s，CH2)。綜上分析，鑒定該化合物為丁二酸(amber acid)。

本文報道的化合物主要為麥角甾類化合物。根據(jù)文獻(xiàn)報道，化合物1對小鼠白血病細(xì)胞P388和人白血病細(xì)胞HL-60均具有較強(qiáng)的抑制活性［3］;化合物2對小鼠肝癌細(xì)胞具有抑制作用［7］;化合物4對小鼠乳腺癌細(xì)胞tsFT210具有中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性［8］。

甾體化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，廣泛存在于生物有機(jī)體內(nèi)。到目前為止，從海洋微生物次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的甾體化合物數(shù)量較少，但有報道稱很多從海綿等海洋生物中發(fā)現(xiàn)的甾體化合物很可能是其附生的微生物的代謝產(chǎn)物。最近研究表明很多來源于海洋微生物的甾體類化合物都具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，具有十分重要的研究與開發(fā)價值，其作用機(jī)制更是有待于進(jìn)一步研究。

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Secondary Metabolites from Marine Fungus Fusarium sp.

LIU Tao1*，LI Zhan-lin2，WANG Yu2，TIAN Li3，4，PEI Yue-hu2，HUA Hui-ming21School of Pharmaceutical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China;2Key Laboratory of Structure-Based Drug Design＆Discovery，Ministry of Education，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China;3The First Institute of Oceanography SOA，Qingdao 266061，China;4Qingdao University of Science＆Technology，Qingdao 266042，China

Five compounds were isolated and purified from the mycelia of marine fungus Fusarium sp.by using silica gel，Sephadex LH-20，open ODS column chromatography and HPLC.On the basis of spectral data and physicochemical properties，their structures were elucidated as 3β，15β-dihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-5，8(14)，22-triene-7-one(1)，3β，5α，9α-trihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-6-one(2)，(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5α，6β-triol (3)，5α，8α-epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-dien-3β-ol(4)，and amber acid(5).Compounds 1 and 2 were isolated for the first time from this genus of marine fungus.

marine fungus;Fusarium sp.;secondary metabolite;ergosterol

1001-6880(2012)08-1047-04

2011-08-30 接受日期:2011-11-24

國家自然科學(xué)基金(20872094);國家863項(xiàng)目(2007AA09Z413，2007AA09Z435)

*通訊作者 Tel:86-24-23256666-5239;E-mail:lnliutao@yahoo.com.cn

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