大蒜辣素(二烯丙基硫代亞磺酸酯)性質(zhì)及相關(guān)研究進(jìn)展

李新霞，林守峰，陳 堅(jiān)，2

1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化有機(jī)教研室，烏魯木齊830054;2新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊，830011

大蒜辣素(二烯丙基硫代亞磺酸酯)性質(zhì)及相關(guān)研究進(jìn)展

李新霞1，2*，林守峰1，陳 堅(jiān)1，2

1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化有機(jī)教研室，烏魯木齊830054;2新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊，830011

大蒜辣素作為大蒜的主要生物活性物質(zhì)因其不穩(wěn)定性使用受到很大限制，本文綜述了大蒜辣素的理化性質(zhì)及穩(wěn)定性和大蒜辣素制備及分析方法等研究的相關(guān)進(jìn)展。

大蒜辣素;理化性質(zhì);穩(wěn)定性

大蒜是多年生百合科蔥屬植物蒜(Allium sativum L.)的地下鱗莖，是歷史悠久的藥食兩用植物。大蒜中公認(rèn)的標(biāo)志性成分是蒜氨酸(alliin)和大蒜辣素(allicin)［1］，大蒜辣素作為大蒜的主要生物活性物質(zhì)，由Cavallito和Bailey在1944年首先從碾碎的大蒜中分離得到，并由Cavallito第一個(gè)闡明碾碎大蒜有氣味成分的物理性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)，并命名為“allicin”，化學(xué)結(jié)構(gòu)為CH2=CH-CH2-S(O)-S-CH2-CH=CH2［2，3］。大蒜辣素是大蒜被粉碎后生成的一個(gè)含氧硫化物，它的前體化合物蒜氨酸是穩(wěn)定的，與蒜酶(蒜氨酸裂解酶，Alliinase)分處大蒜細(xì)胞的不同部位，大蒜經(jīng)粉碎后，蒜氨酸與蒜酶相遇，快速反應(yīng)產(chǎn)生大蒜辣素(圖1)。因此完整、新鮮的大蒜中并沒有大蒜辣素，大蒜辣素不穩(wěn)定，可進(jìn)一步分解為一系列含硫的化合物。

圖1 蒜酶催化裂解蒜氨酸生成大蒜辣素、丙酮酸和氨Fig.1 Alliinase catalytic enzymolysis alliin to generated allicin，pyruvate and amonia

國(guó)外大量文獻(xiàn)報(bào)道大蒜辣素的藥理作用，但因其不穩(wěn)定性，對(duì)進(jìn)一步深入進(jìn)行大蒜辣素的藥學(xué)研究等帶來一定困難。

1 大蒜辣素的理化性質(zhì)

大蒜辣素(allicin，Diallyl thiosulfinate)，化學(xué)名為二烯丙基硫代亞磺酸酯(2-propene-1-sulfinothioic acid，S-2-propenyl ester)，分子式C6H10OS2，分子量162.23，純大蒜辣素為無色油狀液體，比重1.112 (20℃，d20)，折射率(n20D)1.561，無旋光性，10℃時(shí)在水中的溶解度約為2.5%，溶于乙醇、苯、乙醚等有機(jī)溶劑［4］。

圖2 大蒜辣素(Allicin)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structure of allicin

純大蒜辣素對(duì)皮膚有刺激性，與其他烯丙基硫化物相比更具有蒜香味［5］。大蒜辣素水溶液的pH值約為6.5，靜止可見油狀沉淀，隨著少量二氧化硫的形成，酸性略有增加，加入堿后烯丙基二硫化物沉淀立即失活，并形成堿性亞硫酸鹽［2］。對(duì)熱和堿不穩(wěn)定，對(duì)酸較穩(wěn)定［6］。

德國(guó)Herwig Jansen［7］等1987年報(bào)道大蒜辣素純品為淡黃色油狀液體，采用高效液相的二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)大蒜辣素的UV光譜，最大吸收波長(zhǎng)為202 nm，特征肩峰接近240 nm，與大蒜辣素水溶液的光譜數(shù)據(jù)一致(圖3)。將大蒜辣素于鋁鏡表面成膜，采用反射技術(shù)測(cè)定了大蒜辣素的紅外光譜(圖4)。

2 大蒜辣素的穩(wěn)定性研究

大蒜辣素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、熱或有機(jī)溶劑降解成各種含硫有機(jī)化合物(圖5)。Brodnitz發(fā)現(xiàn)大蒜辣素在20℃ 經(jīng)20小時(shí)后幾乎完全分解為二烯丙基二硫化物(diallyl disulfide，66%)、二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide，9%)、二烯丙基硫化物(diallyl sulfide，14%)、二氧化硫(sulfur dioxide)及微量的大蒜辣素脫水產(chǎn)物(4和5)［8］。

圖5 蒜酶催化裂解蒜氨酸生成大蒜辣素及大蒜辣素進(jìn)一步分解過程及產(chǎn)物Fig.5 Alliinase catalytic enzymolysis alliin to generate allicin and the further decomposed product of allicin

Lawson［9］課題組將大蒜粉碎后提取大蒜辣素，研究結(jié)果顯示23℃時(shí)16 h后被分解，半衰期為30～40 d，但大蒜辣素稀的水溶液更穩(wěn)定一些。該課題組后期又報(bào)道，室溫下純大蒜辣素半衰期是2～16 h;在大蒜汁或破碎大蒜中其半衰期是2.4 d;1∶1大蒜汁和水的稀釋液中半衰期是22 d。冷凍干燥可以使大蒜辣素的壽命延長(zhǎng)20 d［10］。

日本研究人員Hiroyuki［11］等以美國(guó)LKT實(shí)驗(yàn)室(LKT Laboratories，MN，USA)提供的含量為99.39%的大蒜辣素對(duì)照品(需在-70℃保存，用時(shí)開啟)，研究大蒜水提取物中的大蒜辣素的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)時(shí)間30 d，在一定溫度，大蒜辣素的減少與時(shí)間的關(guān)系符合一級(jí)動(dòng)力學(xué):Nt=N0e-kt。Nt與N0分別為第t天與第一天大蒜辣素的量，并根據(jù)獲得的穩(wěn)定性曲線獲得k值后計(jì)算半衰期，半衰期t1/2=ln1/ 2/k=-0.693/-k。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，4℃時(shí)大蒜辣素的半衰期約為1年(濃度從1.8 mg/mL降至0.9 mg/mL)，15℃時(shí)的半衰期為32 d，37℃時(shí)的半衰期僅為1 d (濃度從2.0 mg/mL降至1.0 mg/mL)。23℃時(shí)的半衰期為9.4 d，此數(shù)據(jù)結(jié)果與Lawson課題組研究結(jié)果不一致，Hiroyuki認(rèn)為穩(wěn)定性與大蒜辣素溶液的濃度有關(guān)，差異是濃度不相同所致。

3 大蒜辣素的制備方法

文獻(xiàn)報(bào)道大蒜辣素的制備方法主要有生物合成法［12］和化學(xué)合成法［13］。

Herwig Jansen［7］等以二烯丙基二硫化物、間氯過氧苯甲酸為原料化學(xué)合成大蒜辣素，用氯仿、水、乙醚多步提取后減壓除去溶劑，得到大蒜辣素的粗品。以Sephadex LH-20(26×580 mm)進(jìn)行柱分離，粗品中加入150℃干燥的硅膠，于室溫干燥的空氣流除去乙醚。硅膠-大蒜辣素吸附物于干燥器中以98%硫酸干燥，置于-24℃貯存，三個(gè)月大蒜辣素對(duì)照品的含量和純度沒有明顯減少。硅膠吸附前與吸附干燥后之差為大蒜辣素的量，使用時(shí)以流動(dòng)相提取吸附的大蒜辣素，可作為大蒜辣素對(duì)照品，以HPLC測(cè)定純度大于99%，IR、MS對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)。

美國(guó)專利［14］報(bào)道生物合成法制備大蒜辣素，專利中特別指明蒜酶為天然來源，蒜氨酸采用天然來源或人工合成，制成一定濃度水溶液后與蒜酶反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇笏饫彼?。以低沸點(diǎn)非極性溶劑提取大蒜辣素?？傻玫降拇笏饫彼丶兤?，但必須保存在-70℃，以防止大蒜辣素分解。

Gregorio［13］采用另一種化學(xué)合成法:稱取1 g二烯丙基二硫化物，50 mL二氯甲烷溶解;稱取1.69 g單過氧鄰苯二甲酸鎂(3.42 mmol)(MMPO)和232 mg(0.68 mmol)的(Bu)4NHSO4，用50 mL水溶解后，用0.1 M NaOH中和，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.6，將兩溶液加入500 mL的燒瓶中，在室溫下，攪拌反應(yīng)1 h，移走水相，有機(jī)相再加50 mL pH 6.6的0.1 mol/L的碳酸銨進(jìn)行清洗，放入-20℃冰箱1 h，迅速真空抽濾，濾液放在-80℃保存。取12 mL濾液，用N2氣流吹去溶劑使成4 mL，用制備型TLC進(jìn)行分離(條件:硅膠G，正己烷-異丙醇(92∶8)為展開劑)，刮下Rf=0.3處的硅膠，用二氯甲烷提取，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，得油狀殘?jiān)?，?0 mL水溶解后，用C18小柱進(jìn)行固相萃取，得純度相對(duì)較高的大蒜辣素。

Rabinkov［15］課題組使用N，N'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)或者對(duì)硝基苯基氯甲酸酯活化載體生成穩(wěn)定的固定化蒜酶，固定化的蒜酶在室溫下被裝入柱中，蒜氨酸溶液以7 mL/h流速注入柱中，連續(xù)產(chǎn)生大蒜辣素，大蒜辣素生產(chǎn)的效率與固定化酶的比活力有直接的比例。以合成或天然提取的高含量蒜氨酸為原料，蒜酶催化蒜氨酸反應(yīng)可生成純度較高的大蒜辣素，一般以有機(jī)溶劑提取時(shí)可能會(huì)使蒜酶失活，美國(guó)專利［14］報(bào)道正戊烷、乙醚和氯仿不會(huì)使蒜酶失活，但甲醇水溶液中甲醇含量大于80%時(shí)，會(huì)抑制蒜酶活力。

4 大蒜辣素的分析方法

Fujiwara［16］等1955年報(bào)道了大蒜辣素紙層析色譜鑒別大蒜辣素的方法，詳細(xì)描述了展開系統(tǒng)、顯色劑及Rf值。

第一個(gè)定量測(cè)定大蒜辣素的方法是根據(jù)丙酮酸的專屬性反應(yīng)，即丙酮酸與2，4-二硝基苯肼的反應(yīng)［17］，之后還有采用丙酮酸與亞硝基鐵氰化鈉和疊氮碘、N-乙基順丁烯二酰亞胺及氫氧化鉀的2-丙醇溶液［18-20］。這些測(cè)定方法均為比色法，最大的缺陷是產(chǎn)生的物質(zhì)不穩(wěn)定，此外由于蒜酶裂解大蒜中所有的烷基半胱氨酸亞砜均能生成丙酮酸，所以測(cè)定值比實(shí)際值偏高。

由于大蒜辣素對(duì)熱不穩(wěn)定，有研究采用GC或GC-MS研究了大蒜辣素分解產(chǎn)物，如二硫化物和三硫化物［21，22］來確定大蒜辣素的量。

HPLC法是直接定性和定量測(cè)定大蒜辣素及大蒜中的其他成分的方法，由于大蒜辣素對(duì)照品來源有限，大多采用內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定大蒜辣素含量［23，24］。

Marta de Diego［25］等采用RP-C18(4×125 mm)色譜柱，流動(dòng)相:甲醇-水(50/50，v/v)，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。羥苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)物，用來檢測(cè)大蒜粉和大蒜片劑中潛在大蒜辣素的含量。

目前歐洲藥典6.0［26］收載的“garlic powder”中大蒜辣素的含量測(cè)定也是以羥苯丁酯為內(nèi)標(biāo)物，采用C18柱(4×250 mm，5 μm)，甲醇-1%甲酸(60∶40)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。測(cè)定大蒜辣素峰面積，按1 mg羥苯丁酯相當(dāng)于8.65 mg的大蒜辣素計(jì)算含量。

袁耀佐［27］對(duì)歐洲藥典中測(cè)定大蒜辣素的方法進(jìn)行了改進(jìn)。采用羥苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)物，檢測(cè)波長(zhǎng)改為242 nm，確定1 mg羥苯乙酯相當(dāng)于4.71 mg的大蒜辣素。

Herwig Jansen［7］等化學(xué)合成了大蒜辣素對(duì)照品，直接用外標(biāo)法HPLC反相色譜，流動(dòng)相為甲醇: 0.1%甲酸水=60∶40，大蒜辣素得到很好分離，以二極管陣列檢測(cè)器，測(cè)定多個(gè)波長(zhǎng)處的峰高比例，得到對(duì)照品的純度，并測(cè)定了地中海區(qū)域鮮蒜中的大蒜辣素潛在含量。

Rabinkov［28］研究小組采用高效液相色譜法RPC18柱，甲醇∶0.1%甲酸=60∶40同時(shí)測(cè)定蒜氨酸和大蒜辣素，并建立一種衍生化光譜法測(cè)定大蒜辣素的含量。

5 展望

大蒜辣素是大蒜發(fā)揮藥效的主要活性成分之一，將其開發(fā)為治療藥物是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，并且愈來愈受到關(guān)注。早在1944年Cavallito［1］就報(bào)道了小鼠毒性試驗(yàn)表明，大蒜辣素水溶液的靜脈給藥LD50為 60 mg/kg、皮下給藥 LD50為 120 mg/kg。Rabinkov［29］課題小組進(jìn)行大蒜辣素藥物研究在2004年進(jìn)入研發(fā)二期(Phase II)，應(yīng)用類別為抗菌，抗真菌，抗感染治療，抗血小板治療，凝血功能障礙治療，血液學(xué)藥物，脂蛋白質(zhì)紊亂治療，代謝藥物。由于大蒜辣素不穩(wěn)定，動(dòng)物試驗(yàn)所用的大蒜辣素為臨用前由蒜氨酸與蒜酶反應(yīng)制備，但蒜氨酸為合成品。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)大蒜辣素形成的兩個(gè)關(guān)鍵因素蒜酶和蒜氨酸作了大量深入的研究，同時(shí)也對(duì)大蒜辣素的藥用活性和檢測(cè)方法進(jìn)行了大量研究，但由于大蒜辣素極不穩(wěn)定，為從分子水平研究大蒜辣素作用機(jī)制帶來一定困難。對(duì)大蒜辣素理化性質(zhì)的充分認(rèn)識(shí)，有利于進(jìn)一步分離、提取、純化、分析檢測(cè)和保存大蒜辣素，使大蒜中的這一有效成分的開發(fā)和利用取得突破性進(jìn)展。

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Research Advances on Properties of Allicin (Diallyl-thiosulfinate)and Its Relevant Study

LI Xin-xia1，2*，LIN Shou-feng1，CHEN Jian1，21Department of Medicinal and Organic Chemistry，School of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China;2Xinjiang Ailexin Pharmaceutical Co.，Ltd，Urumqi 830011，Xinjiang，China

Allicin is the main bioactive substance of garlic.This paper reviewed the research advances of the physicchemical property and the stability of allicin and preparative and analytical method.

allicin;physic-chemical property;stability

1001-6880(2012)01-0132-05

2010-01-06 接受日期:2010-06-04

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2007BA130B02-4);科技部國(guó)家中小企業(yè)創(chuàng)新基金(07C26216502091);自治區(qū)科技支疆計(jì)劃(200891124)

*通訊作者 Tel:86-991-4365034;E-mail:lxx6668@163.com

R284.1;R284.2;R284.3

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