氨氯地平對ox-LDL誘導人單核巨噬細胞MMP-9表達的影響1）

宋海彬，高 振，申曉彧

冠狀動脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉為不穩(wěn)定，繼而破裂導致血栓形成，是急性冠脈綜合征（ACS）最主要的發(fā)病機制［1］。基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）是 MMPs家族中的重要成員，是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）代謝的關鍵酶之一，在動脈粥樣斑塊處的血管重構、斑塊的不穩(wěn)定及破裂誘發(fā)的ACS中都起著十分重要的作用［2］。

氨氯地平（Amlodipine）是廣泛用于臨床的第三代新型長效二氫吡啶類鈣通道阻滯劑（calcium channel blockers，CCB），臨床上主要應用于高血壓治療的一線用藥。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康成人靜脈血液來自山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)院體檢中心；人淋巴細胞分離液（Lymphocytes Separation Medium1077）為上海華精生物高科技有限公司產品；RPMI-1640培養(yǎng)液；胎牛血清為杭州四季青公司產品；佛波酯購自美國SIGMA公司；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）為北京協生生物科技有限公司產品；FITC-CD14抗體購自日本Beckman Coulter公司。RNA提取試劑盒（TransZol）購自北京全式金生物技術公司；逆轉錄-多聚酶聯反應（RT-PCR）試劑盒購自北京全式金生物技術公司；引物序列由上海生工生物有限公司合成；酶聯免疫（ELISA）試劑盒購自美國R＆D公司；氨氯地平為輝瑞公司饋贈。

1.2 巨噬細胞分離、培養(yǎng)、誘導和鑒定 取肝素抗凝靜脈血30 mL分裝到10個離心管，用RPMI-1640液稀釋1倍并充分混勻，分別緩慢加入等比例淋巴細胞分離液于離心管中，2 000 r／min離心20min后，吸取中間環(huán)狀云霧狀淋巴細胞層，再以3 mLPBS液充分混勻，1 500r／min離心洗滌2次；用含10%胎牛血清的RPMI-1640各5mL將細胞吹開混勻，取細胞懸液至培養(yǎng)瓶，每瓶4mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)至4代后于細胞指數生長期進行誘導轉化實驗。誘導轉化時，以40 ng／mL的PAM無胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h～72 h，待細胞轉化為巨噬細胞后以RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次，置于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48h。臺盼藍染色法測定細胞存活率。用特異性熒光素標記的CD14細胞表面抗體行流式細胞術進行單核細胞源性巨噬細胞鑒定。

1.3 試驗分組 試驗共分5個組?？瞻讓φ战M，不進行任何干預，僅單獨培養(yǎng)單核巨噬細胞24h；ox-LDL對照組，只加入ox-LDL 100mg／mL孵育24h；試驗三組分別加入100mg／mL ox-LDL孵育2h后，再分別加入氨氯地平低劑量0.1μmol／L；中劑量1.0μmol／L；高劑量10.0μmol／L培養(yǎng)24h。

1.4 半定量RT-PCR檢測MMP-9mRNA的表達水平

1.4.1 RNA提取 棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，每瓶加入1.0mL Trizol，依次加入氯仿、異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后略晾干，溶于25μL DEPC中。核酸紫外分析儀檢測，根據260／280比值，所有樣品A260／A280比值1.9～2.0。并根據260nm的吸光度值對樣品的總RNA進行初步定量，確定樣品中RNA純度和含量。

1.4.2 反轉錄反應 反轉錄反應在20μL體系中進行：含1μg RNA，20mg／L 的 oligo（dT）引 物，1.0mml／L dNTP，20U Rnase抑制劑，1×Buffer，200UM-MLV反轉錄酶。于PCR儀上42℃反應1h，72℃滅活10min后保存于-20℃冰箱中。

1.4.3 PCR擴增反應 MMP-9上游引物序列為：5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′； 下 游 引 物 序 列 為：5′-GGCAAGTCTTCCGAGTAGTTT-3′。PCR反應條件：95℃預變性5min，94℃變性30s，58℃退火60s，72℃延伸60s，循環(huán)29次；末次延伸7min，產物長度為307bp。B-actin上游引物序列：5′-CCTGAGGCACTCTTCCAG-3′，下 游 引 物 序 列：5′-TCACACTTCATGATGGA-3′，產物大小100bp。

1.4.4 凝膠電泳 取PCR產物10μL在瓊脂糖凝膠上電泳，計算機凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，Toptal軟件分析灰度值，以各條帶與β-actin內參條帶灰度比值，代表 MMP-9mRNA轉錄水平。

1.5 酶聯免疫吸附雙抗體夾心法測定MMP-9蛋白含量 取六孔培養(yǎng)板上清液進行酶聯免疫吸附雙抗夾心法（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）測定，每組重復6次。

1.6 統(tǒng)計學處理 計量資料以均數±標準差（x±s）表示，用SPSS 13.0建立數據庫，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 ox-LDL誘導的單核巨噬細胞MMP-9mRNA表達 與空白對照組比較，ox-LDL各組MMP-9mRNA表達明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL對照組比較，不同劑量氨氯地平組MMP-9 mRNA表達明顯降低（P＜0.05）；ox-LDL誘導后，不同劑量氨氯地平各組之間比較，隨著氨氯地平劑量增加，MMP-9mRNA表達逐漸降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 ox-LDL誘導的單核巨噬細胞MMP-9蛋白表達 與空白對照組比較，ox-LDL對照組MMP-9蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL對照組比較，不同劑量氨氯地平組MMP-9蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。ox-LDL誘導后的不同劑量氨氯地平組之間比較，隨著氨氯地平劑量增加MMP-9蛋白表達逐漸降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組MMP-9mRNA和蛋白水平（x±s）

3 討 論

心血管疾病病理基礎是動脈粥樣硬化，而血栓的形成與炎癥反應在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中的作用非常重要。冠狀動脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉為不穩(wěn)定，繼而破裂導致血栓形成，是急性冠脈綜合征最主要的發(fā)病機制［1］。粥樣硬化斑塊破裂以及血栓介導的急性心肌梗死最重要的決定因素是斑塊的組成成分，單核巨噬細胞的聚集，以及合成MMPs的增多和／或內源性基質金屬蛋白酶抑制物減少，是造成粥樣斑塊纖維帽厚度和抗損傷強度降低，斑塊穩(wěn)定性下降的重要因素［3］。

基質金屬蛋白酶降解細胞外基質致纖維帽變薄破裂，是急性冠脈綜合征臨床事件發(fā)生的重要原因，MMP-9是其中重要一員［4］。MMP-9由活化的巨噬細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞等以蛋白酶原前體的形式從細胞內分泌到細胞外，MMP-9的作用底物有明膠、Ⅳ型和Ⅴ型膠原、蛋白聚糖、彈性蛋白。MMP-9活性增強可導致膠原裂解增加［5］。在動脈粥樣硬化斑塊局部，MMPs主要來源于激活的巨噬細胞和泡沫細胞。近年來有研究發(fā)現，在人動脈粥樣硬化斑塊容易發(fā)生破裂的部位（尤其是斑塊肩部和脂質核處），MMP-1、MMP-2、MMP-9和MMP-3活性均有增高［6］。

氧化低密度脂蛋白作為獨立的危險因素在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展及急性冠脈綜合征形成中占有重要的地位，在動脈粥樣硬化中ox-LDL除了直接導致內皮損傷外，還可以引起單核細胞趨化、巨噬細胞源泡沫細胞形成和細胞毒性產生 ，并且可以調節(jié)粥樣斑塊內血管內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞等多種細胞和生長因子的合成［7］。ox-LDL可增加單核細胞源巨噬細胞MMP-9的蛋白表達并增強其活性，是細胞功能和基因表達的主要調節(jié)因子［8］。

氨氯地平可能機制有抗氧化、抗炎、改善內皮功能、抑制血管平滑肌增殖與遷移、保持斑塊穩(wěn)定性等［9］。

本研究用ox-LDL誘導人單核巨噬細胞24h后，與單核巨噬細胞組相比，MMP-9mRNA及其蛋白表達增加，與文獻報道一致；ox-LDL誘導人單核巨噬細胞2h后，加入不同劑量的氨氯地平，與ox-LDL空白對照組相比，MMP-9的表達減少且與氨氯地平的劑量有濃度劑量依賴關系。氨氯地平可通過抑制ox-LDL誘導的人單核巨噬細胞MMP-9的表達，發(fā)揮穩(wěn)定粥樣斑塊和抗炎的作用，減少急性冠脈事件的發(fā)生，但其通過何種途徑減少MMP-9的表達，還有待進一步研究。

［1］ Libby P，Theroux P.Pathophysiology of coronary artery disease［J］.Circulation，2005，111：3487-3488.

［2］ Yla-Hrttuala S，Lipton BA，Rosenfeld ME，et al.Expression of monocyte chemoattractan protein-1in maceophage-rich areas of human and rabbit atherosclerosis lesions［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88（12）：5252-5256.

［3］ Newby AC.Dual role of matrix metalloproteinases（matrixins）in intimal thickening and atherosclerotic plaque rupture［J］.Physiol Rev，2005，85（1）：1-31.

［4］ Shah PK，Falk E，Badimon JJ，et al.Human monocyte derived macrophages induce collagen breakdown in fibrous caps of atherosclerotic plaques.Potential role of matrix-degrading metalloproteinases and implications for plaque rupture［J］.Circulation，1995，92（6）：1565-1569.

［5］ Nonoto K，Oguchis W，Alanabn，et al.Involvement of inflamrnation in acute coronary syndormes assessed by levels of high-sensitive C-reactive protein，matrix metalloproteinase-9and soluble vascular-cell adhesion molecule-1 ［J］.J Cardio1，2003，42（5）：201-206.

［6］ Galis ZS，Sukhova GK，Lark MW，et al.Increase expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques［J］.J Clin Invest，1994，94（6）：2493-2503.

［7］ Steinberg D.Oxidative modification of LDL and atherogenesis［J］.Circulation，1997，95（4）：1062-1071.

［8］ Xu XP，Meial SR，Ong JM，et al.Oxidized low density lipoprotein regulates matrix metalloproteinase-9and its tissue inhibition in human monocyte-derived macrophages［J］.Circulation，1999，99（8）：993-998.

［9］ 徐麗梅，涂玉林.氨氯地平抗動脈粥樣硬化研究進展［J］.中國動脈粥樣硬化雜志，2008，3（15）：241-243.