大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)模型的制備1）

鞏 婷，郭利平，姜 民，張智萃

1986年由Murry等［1］首先提出心肌缺血預(yù)適應(yīng)（IP）的概念，揭示了反復(fù)短暫的缺血可使心肌在隨后的較長時(shí)間缺血中得到保護(hù)，延緩心肌細(xì)胞死亡的速度，它是機(jī)體組織細(xì)胞在漫長的生物進(jìn)化過程中獲得的一種內(nèi)在抗損傷能力。這一概念的提出，為缺血心肌的保護(hù)及其機(jī)制探討開辟了嶄新的領(lǐng)域。缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用表現(xiàn)為兩個(gè)時(shí)相，即快速相和延遲相?？焖傧嗉丛缙诒Ｗo(hù)，指缺血1次～4次，每次2min～10min的刺激，數(shù)分鐘內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，此時(shí)的保護(hù)作用是短暫的，可持續(xù)2 h～3h。延遲相指在早期IP消失24h后再度發(fā)生的保護(hù)效應(yīng)，可持續(xù)24h～72h，故又稱為“第二窗口”保護(hù)。雖然此期作用不如早期強(qiáng)，但其持續(xù)時(shí)間是早期保護(hù)作用的30倍～50倍，更具有實(shí)用意義，具有更廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。本文旨在為缺血預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)作用的研究提供可靠模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)健康成年Wistar大鼠30只，雄性，體重（220±20）g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組）、心肌缺血預(yù)適應(yīng)組（IP組）、缺血再灌注組（IR組），每組10只。

1.2 主要儀器和試劑 動(dòng)物人工呼吸機(jī)：DH-140型（浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠生產(chǎn)）；生理信號(hào)記錄分析系統(tǒng)Biopac MP150（Biopac Systems公司，美國）；半自動(dòng)生化分析儀：Microlab 300型（威圖公司，荷蘭）；眼科手術(shù)器械；7-0縫合細(xì)線；縫合針線；心肌酶譜試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司提供）。

1.3 藥物 烏拉坦（由天津元復(fù)精細(xì)化工研究所提供）；氯化三苯基四氮唑（TTC）（Sigma公司）；青霉素；生理鹽水；酒精。

1.4 模型制備

1.4.1 術(shù)前準(zhǔn)備 適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，術(shù)前12h禁食，術(shù)前1h禁水。大鼠稱重，20%烏拉坦（0.5mL／100g）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。左側(cè)胸部皮膚去毛，碘伏消毒。將針形電極插入四肢皮下，連接生理信號(hào)記錄分析系統(tǒng)采集心電圖，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。

1.4.2 模型制備 IP模型建立：經(jīng)口腔進(jìn)行氣管插管，連接動(dòng)物人工呼吸機(jī)，潮氣量5mL／100g，呼吸頻率70次／min～80次／min，呼吸比為2∶1給予呼氣末持續(xù)正壓呼吸。待呼吸、心率穩(wěn)定后，沿胸骨左緣0.5cm第3～第5肋骨心臟搏動(dòng)顯著處，沿肋骨走行斜向作1.5cm切口。用止血鉗鈍性分離淺筋膜、深筋膜及肌肉層，充分暴露第3～第5肋骨，可見心臟暗影，用彎頭止血鉗在心臟搏動(dòng)最明顯的肋間隙打開胸腔，輕輕打開止血鉗向兩側(cè)撐開胸腔，即可暴露心臟。左手輕輕擠壓右側(cè)胸腔，借助心臟跳動(dòng)之勢(shì)，將心臟擠出胸腔之外，左手食指、拇指及中指固定心尖，方向朝上，防止心臟搏動(dòng)時(shí)縮回胸腔，充分暴露心臟，在左心耳和肺動(dòng)脈圓錐間找到與左冠狀動(dòng)脈伴行的冠狀靜脈，在左心耳下方2mm處以7-0無損傷縫合針穿過心肌表層，進(jìn)針深度為1.5mm，寬度為2mm～3mm，在肺動(dòng)脈圓錐旁出針。然后迅速將心臟放回胸腔，輕壓胸腔排出開胸后進(jìn)入胸腔的氣體，使胸腔形成負(fù)壓，然后用直頭止血鉗輕輕夾閉傷口。觀察心電圖，待其恢復(fù)穩(wěn)定10min后打開止血鉗，作一活結(jié)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，將縫合線的兩端留置體外備用，止血鉗夾閉傷口。5min后打開止血鉗，拉動(dòng)縫合線兩端解開活結(jié)，若細(xì)線可隨意拉動(dòng)說明活結(jié)完全打開，然后用止血鉗夾閉傷口5 min。重復(fù)以上操作3次后逐層縫合肌肉和皮膚，將縫合線兩端穿過胸腔開口處及肌層埋于皮下。逐漸減小通氣量，等大鼠有自主呼吸后拔除氣管插管，腹腔注射青霉素以抗炎。將大鼠由仰臥位擺至右側(cè)臥位，注意保暖，待其蘇醒。24h后逐層打開皮膚、肌層及胸腔，整理縫合線兩端方向不致交叉，以可拖動(dòng)為準(zhǔn)，快速將其再作一活結(jié)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，直頭止血鉗夾閉傷口30min，然后松開止血鉗，拉動(dòng)縫合線兩端解開活結(jié)，抽出縫合線，止血鉗夾閉傷口再灌2h。IR模型建立：省略重復(fù)3次5min夾閉左冠狀動(dòng)脈前降支及5min再灌過程，其余操作同IP模型。S組大鼠冠狀動(dòng)脈下只穿線不結(jié)扎。

1.5 指標(biāo)檢測 于腹主動(dòng)脈取血2mL，標(biāo)本靜置30min后置于離心機(jī)中離心10min（3 000r／min，4℃），取上清。采集的血清使用半自動(dòng)生化分析儀測定谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平。

1.6 心肌梗死面積測定 采血后立即取出心臟，生理鹽水沖洗后用濾紙吸去水分。沿冠狀溝剪去心房及右心室后用電子天平稱重左心室，從心尖到心室底部平行將心室切成2mm厚的薄片，將心肌置于1%TTC磷酸緩沖液（pH7.4）中，37℃水浴20 min后取出沖凈濾干水分，梗死區(qū)未染色，非梗死區(qū)呈磚紅色，剪下梗死區(qū)心肌以電子天平稱重后按下列公式計(jì)算出心肌梗死區(qū)的百分比作為心肌梗死范圍［2］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 模型制備成功判定

2.1.1 模型成活率 IP組造模后成活9只，模型成活率為90%；IR組造模后成活9只，模型成活為90%。S組由于僅穿線不結(jié)扎，存活率為100%。IP組與IR組各死亡1只，均為結(jié)扎冠脈30min過程中死亡。

2.1.2 肉眼觀察 結(jié)扎血管后血管供應(yīng)范圍心肌發(fā)紺或蒼白，再灌注后，心肌發(fā)紺消失或減輕，蒼白心肌部分恢復(fù)紅色。IP組心肌發(fā)紺或蒼白程度低于IR組。S組無變化。

2.1.3 心電圖ST段變化情況 IP組、IR組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支時(shí)均出現(xiàn)QRS波群增高、增寬，ST段弓背抬高；再灌注中后期QRS波群降低，ST段及T波回落，在缺血后期及再灌注期部分可出現(xiàn)室性期前收縮及室性心動(dòng)過速，IP組明顯少于IR組。假手術(shù)組心電圖無明顯改變。

2.2 心肌酶水平變化及心肌梗死范圍比較 IP組、IR組血清心肌酶AST、LDH、CK、CK-MB顯著高于S組（P＜0.05）；IP組心肌酶AST、LDH、CK、CK-MB水平低于IR組（P＜0.05）；IP組心肌梗死范圍小于IR組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組血清心肌酶含量及梗死范圍比較（x±s）

3 討 論

隨著冠心病發(fā)病率的逐年上升，心絞痛和心肌梗死已成為威脅人類健康的主要疾病。如何降低心絞痛發(fā)作的頻率和程度，防止心肌梗死的發(fā)生，以及心肌梗死后如何縮小梗死面積，已經(jīng)成為當(dāng)今心血管疾病研究的重點(diǎn)。IP是心臟固有的、目前已知效果最強(qiáng)的心臟自我保護(hù)機(jī)制，其能夠有效地對(duì)抗缺血再灌注所造成的各種心肌損傷，誘導(dǎo)方法多樣，保護(hù)效應(yīng)持久［3］。延遲保護(hù)作用因其作用時(shí)間跨度大，在臨床運(yùn)用時(shí)更具有可行性。因此，成功制備大鼠缺血預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)模型為臨床研究奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)制備的模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：不需剪斷大鼠肋骨，減少了動(dòng)物創(chuàng)傷，降低了死亡率；進(jìn)行心肌缺血預(yù)處理實(shí)驗(yàn)時(shí)需要反復(fù)3次結(jié)扎再灌冠脈，因此不可能反復(fù)多次將心臟拉到胸腔外。此模型只需將心臟從胸腔中擠出1次，操作完畢后快速將心臟回納胸腔，整個(gè)過程控制在1min以內(nèi)。并采用打活結(jié)的方法，將縫合線兩端置于傷口外，便于再灌時(shí)打開活結(jié)。缺血預(yù)適應(yīng)結(jié)束后將縫合線兩端穿過胸腔、肌層埋于皮下，24h后逐層打開皮膚、肌層及胸腔，進(jìn)行長時(shí)間缺血再灌，避免了再次將心臟擠出胸腔，此法大大降低了對(duì)心臟電生理功能的影響；經(jīng)口腔進(jìn)行氣管插管，操作簡單，減少創(chuàng)傷，可避免術(shù)后感染、氣道塌陷、氣道分泌物增多等不良狀況，延長了大鼠存活時(shí)間。此造模方法能夠成功制備心肌缺血預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)模型，實(shí)用性強(qiáng)、成功率高。

［1］ Murry CE，Jennings RB，Reimer KA，et al.Preconditioning with ischemia：A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124-1136.

［2］ 王繼春，江洪.纈沙坦預(yù)處理對(duì)大鼠缺血／再灌注心肌損傷的保護(hù)作用［J］.鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，29（3）：224-226.

［3］ 馬駿，石月萍，趙建宇.溫陽通脈方預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠MDA及SOD的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（6）：664-665.