金蓮花中葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝、腎、腦組織的抗氧化作用

袁丹華 屈海琪 蔣 偉 楊國(guó)棟 安 芳 王書(shū)華 (河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

金蓮花是毛茛科植物金蓮花的干燥花及花蕾，有清熱解毒，消腫明目的功效，臨床上主要用于上呼吸道感染、扁桃體炎、急性腸炎、泌尿系統(tǒng)感染等。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)金蓮花主要有效成分為黃酮類化合物〔1〕，前期研究表明，金蓮花黃酮中含量較高的是葒草苷和牡荊苷〔2〕，金蓮花總黃酮及其單體葒草苷和牡荊苷具有體外抗氧化、抑菌、抗腫瘤等作用〔3～6〕，藥代動(dòng)力學(xué)研究表明葒草苷與牡荊苷在不同種屬動(dòng)物組織的分布均沒(méi)有差異，腎臟中濃度最高，其次是肝，腦中含量最少〔7，8〕。有關(guān)金蓮花黃酮葒草苷和牡荊苷的體內(nèi)抗氧化作用尚未見(jiàn)報(bào)道，通過(guò)比較葒草苷和牡荊苷的體內(nèi)抗氧化作用，以期篩選出抗衰老作用最佳藥物的構(gòu)效關(guān)系，為抗衰老藥物的研究提供新的動(dòng)力。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 野生金蓮花采自河北省張家口沽源，經(jīng)我院藥物研究所鑒定為短瓣金蓮花 ;葒草苷和牡荊苷(自制，經(jīng)1H－NMR和HPLC鑒定純度98.9%);D-半乳糖(D-gal)，分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司;牛血清蛋白，分析純，鄭州益康有限公司;硫酸奎寧，分析純，上海齊奧化工有限公司;5，5-雙硫代對(duì)硝基苯甲酸，分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司;還原性谷胱甘肽，純度≥99%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;磷酸鈉，分析純，天津化工有限公司;鉬酸銨，分析純，天津化工有限公司鄰苯三酚，分析純，上海邦辰試劑有限公司;生理鹽水，石家莊第四制藥廠;超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSH-Px、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒，均購(gòu)買自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物 健康的昆明種小鼠120只(雌雄各半)，河北北方學(xué)院動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK京2004-0001)，分籠飼養(yǎng)，室溫18～25℃。

1.3 儀器 U-3900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本);ME235S十萬(wàn)分之一電子天平(日本);DK-8型電熱恒溫水槽(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);低溫高速離心機(jī)(賽多利斯公司);HQ-60型旋渦混合器(北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模方法 采用D-gal致亞急性衰老法，正常組注射等體積生理鹽水，造模時(shí)間為8 w，每天稱重1次，依據(jù)末次稱重的克數(shù)調(diào)整給藥劑量。

1.4.2 模型驗(yàn)證 造模第6周和第8周分別選取正常組和造模組小鼠(備用)8只，摘眼球采血，分離血清，測(cè)定總抗氧化能力(T-AOC)、SOD含量，以驗(yàn)證小鼠衰老情況。第8周末，造模組小鼠指標(biāo)與正常組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示模型復(fù)制成功。

1.4.3 藥物配制 葒草苷和牡荊苷溶液的配制：N，N-二甲基甲酰胺∶吐溫-80∶生理鹽水 =1∶1∶20。

1.4.4 給藥與分組 造模成功后，實(shí)驗(yàn)分為模型組、正常組、維生素E對(duì)照組、葒草苷和牡荊苷高、中、低各三個(gè)劑量組，各治療組從第9周開(kāi)始每日上午分別口服灌胃給藥，模型組和正常組給等體積的生理鹽水，每日一次。確定葒草苷和牡荊苷高、中、低劑量分別為 40、20、10 mg/kg，維生素 E 對(duì)照組每日20 mg/kg。每日稱重一次，依據(jù)小鼠每次的體重調(diào)整給藥劑量，給藥時(shí)間8 w。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 小鼠一般狀態(tài)的觀察 觀察各組小鼠一般狀態(tài)，如攝食、飲水情況、體重、活動(dòng)度、毛色、光澤度變化等方面，并相互進(jìn)行比較。

1.5.2 小鼠組織中 SOD、CAT、GSH-Px、MDA的測(cè)定 給藥8 w后小鼠斷頭處死，冰浴條件下迅速取出腎、肝、腦組織，精確稱量，用生理鹽水制成10%的組織勻漿液，離心得上清液。取1.0 ml的上清液，加入1.0 ml乙醇-氯仿混合液，震蕩2 min，4 000 r/min離心5 min以除去蛋白質(zhì)，取上清液按試劑盒說(shuō)明操作，測(cè)定SOD、CAT、GSH-Px的活性及MDA。

2 結(jié)果

2.1 金蓮花中葒草苷和牡荊苷對(duì)D-gal致衰老小鼠一般形態(tài)的影響 正常組小鼠飲食正常，活潑好動(dòng)、毛發(fā)光亮、濃密，皮膚彈性良好。模型組小鼠在造模后，逐漸表現(xiàn)出少動(dòng)，行動(dòng)遲緩，喜蜷縮，毛色發(fā)黃，尤其是腹部毛發(fā)逐漸變得無(wú)光澤、稀疏并漸有脫毛現(xiàn)象，皮膚松弛，彈性下降。而各治療組在服用相應(yīng)的藥物后，總體狀態(tài)好于模型組。

2.2 葒草苷和牡荊苷對(duì)D-gal致衰老小鼠腎肝腦組織中SOD、CAT、GSH-Px、MDA的影響結(jié)果 見(jiàn)表1、表2。與正常組相比，模型組小鼠腎、肝、腦組織中SOD、CAT、GSH-Px含量明顯降低，MDA明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.01)。與模型組相比，葒草苷和牡荊苷各治療組均具有提高小鼠組織 SOD、CAT、GSH-Px的作用和降低MDA的作用，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。與維生素E對(duì)照組相比，葒草苷和牡荊苷中、低劑量組提高小鼠肝、腦、腎組織SOD、CAT、GSH-Px的作用和降低MDA的作用較弱，具有顯著性差異(P＜0.05)，高劑量組與維生素E組相比無(wú)顯著性差異。葒草苷中、低劑量組提高小鼠腎、肝、腦組織中SOD、CAT、GSH-Px的作用和降低MDA的作用高于牡荊苷中、低劑量組，具有顯著性差異(P＜0.05)，葒草苷與牡荊苷的高劑量組無(wú)顯著性差異。

表1 各組肝、腎、腦組織SOD、CAT水平( s，n=10)

表1 各組肝、腎、腦組織SOD、CAT水平( s，n=10)

與模型組比較：1)P＜0.01，與維生素E組比較：2)P＜0.05;與葒草甘中劑量組比較：3)P＜0.05;與葒草甘低劑量組比較：4)P＜0.05，下表同

組別 SOD(U/ml)腎肝腦CAT(U/ml)腎肝腦.915 6.625±0.826 6.025±0.908模型組 45.21±7.05 34.40±7.59 41.02±6.07 4.521±0.705 2.940±0.759 2.802±0.607維生素E組 80.36±6.681) 68.36±8.241) 88.36±6.971) 7.236±0.6681) 6.136±8.241) 5.736±0.6971)葒草甘高劑量組 89.76±6.021)2) 71.24±7.821) 67.36±7.121) 7.476±0.6021)2) 6.204±0.7821) 5.836±0.7121)葒草甘中劑量組 80.36±7.591) 60.23±7.061)2) 54.36±7.041)2) 6.236±0.7591) 5.230±0.7061)2) 4.936±0.7041)2)葒草甘低劑量組 68.32±6.341)2) 50.14±8.071)2) 43.36±6.891)2) 5.132±0.6341)2) 3.714±0.8071)2) 4.160±0.6891)2)牡荊苷高劑量組 72.24±6.861)2) 64.01±7.721)2) 58.36±8.011)2) 7.024±0.6861)2) 5.9181±0.6721)2) 5.536±0.8011)2)牡荊苷中劑量組 66.36±7.061)2)3) 56.68±7.911)2)3) 48.36±5.981)2)3) 5.236±0.7061)2)3) 4.068±0.7911)2)3) 4.436±0.5981)2)3)牡荊苷低劑量組 60.36±6.591)2)4) 42.68±8.121)2)4) 43.36±6.131)2) 3.836±0.6591)2)4) 3.268±0.8121)2)4) 3.636±0.6131)2)正常組 104.08±9.15 92.17±8.26 110.24±9.08 8.208±0

表2 各組肝、腎、腦組織GSH-Px、MOA水平( s，n=10)

表2 各組肝、腎、腦組織GSH-Px、MOA水平( s，n=10)

組別 GSH-Px(U/ml)腎肝腦MDA(U/ml)腎肝腦4 14.52±3.26 8.48±2.37模型組 18.39±1.65 17.98±1.15 8.37±1.43 29.68±2.36 24.25±2.54 15.97±3.36維生素E組 32.10±2.041) 30.51±1.671) 14.25±2.071) 18.53±3.271) 17.52±3.141) 10.26±2.011)葒草甘高劑量組 33.42±1.961) 29.88±1.161) 13.34±1.691) 19.10±3.091) 16.35±2.581) 11.22±3.761)葒草甘中劑量組 30.24±1.041) 26.32±1.181)2) 12.40±1.371)2) 21.56±2.541) 18.71±2.021) 12.25±2.631)葒草甘低劑量組 26.21±1.941)2) 22.93±1.201)2) 10.56±2.141)2) 24.65±3.651)2) 20.32±4.011)2) 13.69±3.591)2)牡荊苷高劑量組 32.46±1.021) 27.57±0.941) 13.02±2.031) 20.46±2.581) 17.34±3.611) 11.97±3.241)牡荊苷中劑量組 25.26±1.651)2)3) 23.16±1.061)2)3) 11.93±1.971)2) 22.87±3.521)2) 19.24±2.971) 13.01±3.061)牡荊苷低劑量組 20.64±1.291)2)4) 19.94±1.681)2)4) 10.96±1.211)2) 25.36±2.831)2) 21.04±2.431)2) 13.89±2.521)2)正常組 34.56±1.12 32.46±1.10 16.58±2.05 15.17±3.6

3 討論

D-gal亞急性衰老模型是研究抗衰老藥物的經(jīng)典模型。D-gal在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇，而后者不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝，進(jìn)而造成細(xì)胞代謝紊亂，破壞并消耗機(jī)體抗氧化物質(zhì)，并不斷產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致組織細(xì)胞受損，使細(xì)胞腫脹、功能障礙，從而造成實(shí)驗(yàn)性亞急性衰老模型。

在正常代謝情況下，機(jī)體產(chǎn)生和清除自由基處于一種動(dòng)態(tài)平衡中。內(nèi)源性的清除自由基的酶系有SOD、CAT、GSH-Px等，外源性的清除劑有維生素E、維生素C以及從植物提取出的黃酮類等化合物。T-AOC主要維持內(nèi)環(huán)境活性氧自由基的動(dòng)態(tài)平衡，清除濃度過(guò)高的活性氧自由基，使機(jī)體處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，它可代表抗氧化酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)的變化。SOD可以催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，產(chǎn)生破壞能力相對(duì)較低的H2O2，而CAT和 GSH-Px能將H2O2分解成H2O和O2，減輕或阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化作用的一級(jí)引發(fā)作用，保護(hù)機(jī)體免受過(guò)氧化氫的侵害，延緩細(xì)胞的衰老，從而預(yù)防自由基導(dǎo)致的疾病的發(fā)生〔9，10〕。根據(jù)自由基學(xué)說(shuō)，適當(dāng)補(bǔ)充外源性自由基清除劑，增強(qiáng)肌體自由基防御系統(tǒng)能力，即可達(dá)到抗衰老的目的。MDA是氧自由基引起細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的終產(chǎn)物，是極其活潑的交聯(lián)劑，能與蛋白質(zhì)、核酸等交聯(lián)，從而使其變性甚至失活，MDA可反映機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化程度，間接反映出細(xì)胞的受損程度〔11〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葒草苷和牡荊苷在提高機(jī)體內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px的活性方面發(fā)揮較好的作用，且葒草苷和牡荊苷均能降低組織內(nèi)的MDA的含量，提示葒草苷和牡荊苷可能通過(guò)直接清除體內(nèi)氧自由基，激活抗氧化酶系的防御系統(tǒng)等作用，提高機(jī)體的抗氧化能力，減少自由基對(duì)機(jī)體的損傷，從而起到延緩衰老的作用。其中葒草苷中、低劑量組提高機(jī)體抗氧化酶和降低組織MDA的作用分別比牡荊苷中、低劑量組的作用強(qiáng)，這與文獻(xiàn)所說(shuō)B環(huán)上連有一個(gè)酚羥基的黃酮抗氧化性比B環(huán)上具有鄰二酚羥基的黃酮抗氧化活性要弱些相一致〔12〕。高劑量組與維生素E作用相當(dāng)。

從中醫(yī)理論角度上說(shuō)，腎藏象在中醫(yī)臟腑中占有重要的地位，所謂腎氣絕，則不盡其天命而死也;天壽過(guò)度，氣脈常通，而腎氣有余也〔13〕。腎在抗衰老作用中起著巨大的作用，金蓮花黃酮類單體藥代動(dòng)力學(xué)理論證明金蓮花黃酮單體葒草苷和牡荊苷，在腎中濃度最高，可見(jiàn)金蓮花黃酮類單體具有很大的研究?jī)r(jià)值，也為進(jìn)一步研究的抗氧化作用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本文通過(guò)對(duì)葒草苷和牡荊苷的藥理學(xué)研究，從中醫(yī)的角度證明其具有提高機(jī)體的抗氧化抗衰老的能力。

1 李良千.毛茛科金蓮花亞科植物的地理分布〔J〕.植物分類學(xué)報(bào)，1995;33(6)：535-7.

2 曲彩紅，顏 娟，田嘉銘，等.HPLC測(cè)定金蓮花中三種黃酮苷的含量〔J〕. 中成藥，2010;32(3)：162-4.

3 顏 娟，胡海娜，田嘉銘，等.金蓮花中總黃酮抗氧作用的研究〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010;26(2)：20-2.

4 楊國(guó)棟，饒 娜，田嘉銘，等.金蓮花中葒草苷和牡荊苷的抗氧作用研究〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011;22(9)：110-1.

5 孫 黎，劉 芳，劉 華，等.金蓮花黃酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞作用的研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;29(9)：1098.

6 孫 黎，羅 強(qiáng)，張 力，等.金蓮花黃酮對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響〔J〕. 中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;131(2)：82-3.

7 曲彩紅.金蓮花中葒草苷兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究〔D〕.河北北方學(xué)院.優(yōu)秀碩士學(xué)位論文，2010.

8 顏 娟.金蓮花中牡荊苷兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究〔D〕.河北北方學(xué)院.優(yōu)秀碩士學(xué)位論文，2010.

9 Wang H，Joseph JA.Structure-activity relationships of quercet in antagonizing hydrogenperoxide-induced calciumdysregulat ion in PC 12 cells〔J〕.Free Radical Biol Med，1999;27(5-6)：683-94.

10 桑 琛，李明學(xué).衰老自由基學(xué)說(shuō)和運(yùn)動(dòng)對(duì)抗自由基損傷的作用〔J〕. 吉林體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2007;23(7)：80-1.

11 Gawel S，Wardas M，Niedworok E，et al.Malondialdehyde(MDA)as a lipid peroxidation marker〔J〕.Wiad Lek，2004;57(9-10)：453-5.

12 李順成.衰老實(shí)質(zhì)及中醫(yī)方藥延緩衰老機(jī)理研究思路〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1993;13(6)：1371-3.

13 程 革.金匾腎氣丸延緩衰老作用的理論和實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.南京中醫(yī)藥大學(xué)，2008.