重組人生長停滯特異性蛋白6對(duì)缺氧/復(fù)氧原代心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞損傷的影響

符江琳 劉承云 徐 曉 (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院老年科，湖北 武漢 442000)

生長停滯特異性蛋白6(Gas6)的受體酪氨酸激酶亞家族成員，除表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞外，還廣泛存在于哺乳動(dòng)物的心腦血管組織中〔1，2〕。以往認(rèn)為Gas6因子及其受體作用主要抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，近年來Gas6抑制非腫瘤細(xì)胞凋亡的研究日益增多〔3，4〕，最新研究顯示在肝臟缺血再灌注損傷中，Gas6對(duì)肝細(xì)胞起保護(hù)作用〔5〕，但目前關(guān)于Gas6對(duì)心肌細(xì)胞凋亡影響的報(bào)道少見。我們前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)Gas6及其受體基因均高表達(dá)于缺血再灌注大鼠心臟組織中。抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)于保護(hù)圍心臟手術(shù)、急性心肌梗死及慢性心衰等常見老年病患者有著重大意義。本實(shí)驗(yàn)初步探討外源Gas6(rhGas6)對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷是否有保護(hù)作用，為常見老年病提供可能的臨床心肌保護(hù)治療思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 新生1～3 d的Wistar大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)。H9c2細(xì)胞系購于武漢博士德公司。

1.2 主要試劑 重組人Gas6(R＆D公司)，AnnexinV/PI凋亡試劑盒(AntiGene公司)，DMEM高糖和低糖型培養(yǎng)基(Gibco公司)，混合Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)，胎牛及小牛血清(杭州四季青公司)，乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒及Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(南京建成有限公司)，5-Brdu(武漢博士德公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原代心肌細(xì)胞分離及H9c2細(xì)胞系培養(yǎng) 參閱相關(guān)文獻(xiàn)中方法〔6〕，取出生1～3 d的Wistar乳鼠，無菌條件下取心臟組織，剝離非心肌組織，冰浴PBS漂洗3～4次后，剪成1 mm3組織碎塊，加入5倍體積的0.05%胰蛋白酶及0.025%膠原酶1∶1混合消化液，37℃ 水浴消化4～5次，收集上清細(xì)胞，加入等體積的20%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育90 min，取懸液接種于培養(yǎng)板培養(yǎng)，取培養(yǎng)3 d的呈單層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，搏動(dòng)頻率達(dá)100次/min左右心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。H9c2細(xì)胞系以(1～2)×104/ml接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)中培養(yǎng)，2～3 d用0.25%胰酶消化傳代1次，接種于培養(yǎng)板中，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，密度達(dá) 90%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 心肌細(xì)胞H/R模型的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組 參照Pi等〔7〕方法稍加改進(jìn)，無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，事先用氮?dú)獬浞诛柡?0 min，流量為2 L/min，使溶解氧分壓從20 kPa降至4 kPa。將上述細(xì)胞培養(yǎng)基快速置換掉細(xì)胞培養(yǎng)板中的含血清的高糖培養(yǎng)基，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置入密閉裝置內(nèi)，充滿氮?dú)猓?7℃，原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)3 h后將培養(yǎng)基換為正常培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)復(fù)氧3 h。H9c2細(xì)胞系培養(yǎng)2 h后將培養(yǎng)基換為正常培養(yǎng)基，復(fù)氧3 h。分別取正常培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞系隨機(jī)分3組：①正常組;37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)正常培養(yǎng);②缺氧/復(fù)氧組(H/R組);按照上述構(gòu)建模型培養(yǎng);③缺氧/復(fù)氧+rhGas6組(rhGas6組);于缺氧前15 min在無血清低糖培養(yǎng)基中加入終濃度為100 ng/ml的重組人rhGas6，構(gòu)建模型。每個(gè)組含6個(gè)樣本。

1.3.3 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)及自發(fā)搏動(dòng)情況。

1.3.4 MTT法測(cè)定心肌細(xì)胞活力 取原代心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞，將細(xì)胞密度分別調(diào)至1×105/ml、1×104/ml，取 200 μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，2～3 d后隨機(jī)分組對(duì)應(yīng)處理后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h后，1 000 min×5 min離心后棄上層培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 0.15 ml，震蕩10 min后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度A值(檢測(cè)波長為570 nm)。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值×100%。

1.3.5 乳酸脫氫酶(LDH)的檢測(cè)心肌細(xì)胞損傷程度 原代心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞分別以(1～2)×106/ml、(2～4)×105/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板中，2～3 d后隨機(jī)分組對(duì)應(yīng)處理后，各組6孔板中培養(yǎng)液，依照試劑盒說明書，反應(yīng)后利用721分光光度計(jì)檢測(cè)A值，根據(jù)A值按說明書公式計(jì)算出LDH活力。

1.3.6 Caspase-3活性檢測(cè) 取處理過的各組6孔板，先將細(xì)胞培養(yǎng)液收集于離心管中，用0.25%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，收集于對(duì)應(yīng)的離心管中，按照Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說明書步驟，用酶標(biāo)儀測(cè)定各組的A405值，樣品的A405扣除空白對(duì)照組A405，即為Caspase-3催化產(chǎn)生的pNA的吸光值。根據(jù)測(cè)定出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出對(duì)應(yīng)酶活力單位(UI)(每組6個(gè)復(fù)孔)。

1.3.7 AnnxinV-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 取處理過的各組6孔板，先將可能含有漂浮凋亡細(xì)胞的各組培養(yǎng)液分別收集于流式管中，用胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集于對(duì)應(yīng)的流式管中，4℃、1 000 r/min離心5 min，用冰預(yù)PBS洗滌2次，然后用200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入5 μl AnnexinV-FITC，避光室溫反應(yīng)15 min，再加入10 μl PI避光室溫反應(yīng)5 min或者4℃反應(yīng)30 min，加入250 μl PBS，立即上機(jī)檢測(cè)。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞生長情況及心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率 分離純化原代乳鼠心肌細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，倒置顯微鏡下觀察，4 h后心肌細(xì)胞開始貼壁生長，12 h后逐漸伸展由圓形變?yōu)樗笮巍?4 h后90%細(xì)胞貼壁呈梭形，少數(shù)單個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)不同頻率的自發(fā)性搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率為60～80次/min。48 h后細(xì)胞逐漸向四周擴(kuò)展呈星型，90%波動(dòng)明顯，頻率大概在90～100次/min。72 h后，正常l組細(xì)胞生長良好、成簇生長，搏動(dòng)明顯且節(jié)律規(guī)則;H/R組細(xì)胞偽足縮短或消失、折光性下降、搏動(dòng)頻率(35±7)次/min較正常組(94±3)次/min明顯下降(P＜0.05);與H/R組相比，rhGas6組細(xì)胞生長較好，搏動(dòng)頻率增加(78±6)次/min，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而rhGas6組較正常組細(xì)胞搏動(dòng)頻率改變不明顯。

2.2 各組心肌細(xì)胞存活率的比較 比較原代乳鼠心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞各組OD值，與正常組比較，H/R組細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞活力明顯降低，兩組比較差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;rh-Gas6組與H/R組相比細(xì)胞活力明顯升高(P＜0.05)，但與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 LDH活力測(cè)定的比較 在原代心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞中，H/R組較正常組、rhGas6組 LDH釋放明顯增加，H/R+rh-Gas6組與H/R組相比，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.4 Caspase-3活性檢測(cè) 正常組細(xì)胞Caspase-3活性較低;H/R組活性較正常組增加;rhGas6組活性較H/R組減低(P＜0.05)。見表2。

2.5 各組細(xì)胞凋亡率的比較 rhGas6組、正常組凋亡率明顯低于H/R組(P＜0.05)，rhGas6組與正常組凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 原代心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞各組細(xì)胞存活率和LDH活性變化( s，n=6)

表1 原代心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞各組細(xì)胞存活率和LDH活性變化( s，n=6)

與正常組比較：1)P＜0.05;與H/R組比較：2)P＜0.05，下表同

LDH(UI)PCM H9c2組別 存活率(%)PCM H9c2細(xì)胞94.2±3.3 91.0±4.0 81.50±5.94 61.89±10.16 H/R組 48.5±4.01)43.2±3.51)206.67±16.311)193.83±17.251)rhGas6組 83.5±3.62)82.1±4.32)107.22±8.772)110.67±11.722)細(xì)胞正常組

表2 原代心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞各組細(xì)胞Caspase-3變化( s，n=6)

表2 原代心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞各組細(xì)胞Caspase-3變化( s，n=6)

3.23±0.41 3.02±0.44 2.83±0.42 2.65±0.48 H/R組 10.19±0.781) 8.86±0.701) 14.51±0.821) 12.16±0.681)rhGas6組 5.17±0.642) 4.63±0.502) 5.17±0.642) 5.58±0.532)細(xì)胞正常組組別 Caspase-3 PCM H9c2細(xì)胞凋亡率(%)PCM H9c2

3 討論

細(xì)胞凋亡在急性心肌梗死、急慢性心力衰竭及糖尿病心肌病等眾多心血管疾病中發(fā)揮著重要的病理生理學(xué)作用，尤其在急性心肌梗死早期再灌注治療中，細(xì)胞凋亡不但影響心肌的梗死面積，還促成心臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu)〔8〕。雖然凋亡的發(fā)生是不可逆的，但有大量研究表明細(xì)胞凋亡受一些生長因子或炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，同時(shí)干擾或中斷引起凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，可能對(duì)治療心血管疾病有重要的臨床意義。

Gas6因子能與多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的Axl受體結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，如調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、遷移、黏附和吞噬等作用。近些年研究發(fā)現(xiàn)，Gas6能夠抑制多種非腫瘤細(xì)胞的凋亡，尤其在高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡、缺血的大腦皮層誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及肝臟缺血再灌注損傷中，Gas6起著顯著的保護(hù)作用〔3～6，9〕。這些都預(yù)示著Gas6可能在老年人常見心腦血管疾病中有一定的保護(hù)作用。

以往研究顯示Gas6可能通過以下主要途徑抑制細(xì)胞凋亡：①抑制Caspase-3活性。多種藥物以及細(xì)胞因子介導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用中，Caspase-3 都充當(dāng)著重要角色〔10，11〕。因而Caspase-3活性的測(cè)定成為相關(guān)疾病基礎(chǔ)研究和藥物干預(yù)效果評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。已有研究表明Gas6可通過降低促凋亡蛋白Caspase-3活性，保護(hù)血清剝奪誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔5〕。且在他汀類藥物通過Gas6介導(dǎo)的存活通路阻止血管鈣化過程中，Caspase-3活性也明顯降低，凋亡的血管平滑肌細(xì)胞數(shù)目減少〔12〕;②激活抗凋亡蛋白 NF-κB、Bcl-2，通過激活NF-κB的死亡受體途徑介導(dǎo)。在不少腫瘤細(xì)胞中，Gas 6能誘導(dǎo)NF-κB結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄活性以及使Bcl-2蛋白水平的快速而短暫的升高〔13〕。③抑制細(xì)胞鈣內(nèi)流。早有報(bào)道，在β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的原代大鼠皮層神經(jīng)元凋亡過程中，Gas6可以抑制L型鈣通道，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。

我們前期的研究顯示Gas6及其受體基因高表達(dá)于缺血再灌注大鼠心肌組織，提示Gas6可能有心肌保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)提示Gas6可能通過減少細(xì)胞膜通透性來提高心肌細(xì)胞存活率及抑制Caspase-3活化發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，進(jìn)而減少心肌損傷。另外本實(shí)驗(yàn)利用混合膠原酶及5-Brdu分離并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，基本剔除了Gas6對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的作用因素。更重要的是利用體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞系，排除了體內(nèi)各種體液因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。

前人及我們的研究均顯示Gas6能夠抑制非腫瘤細(xì)胞的凋亡，但Caspase-3作為多種胞內(nèi)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游通路，Gas6具體是如何通過調(diào)節(jié)上游網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，有待進(jìn)一步研究。我們分別在原代乳鼠心肌細(xì)胞和H9c2細(xì)胞系這兩種不同的心肌細(xì)胞中，驗(yàn)證了Gas6可以減少缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，通過抑制Caspase-3活性減少細(xì)胞凋亡，這可能為今后老年患者的缺血性心腦血管疾病的防治提供新的治療思路。

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