煙草中主要揮發(fā)酸的分析方法

彭 艷，廖雅樺，肖 遂，柳 立

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128;2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128)

有機(jī)酸不僅在煙草生長(zhǎng)過程中起著重要的作用，而且對(duì)煙草和卷煙的質(zhì)量有著重要的影響，尤其是揮發(fā)酸，盡管含量很低，但其對(duì)煙草感官質(zhì)量的影響卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于多元酸和高級(jí)脂肪酸[1]。煙草中的揮發(fā)性酸多為C10以下的低級(jí)脂肪酸和部分芳香族酸，乙酸和甲酸是主要的揮發(fā)酸，次要揮發(fā)酸包括丙酸、α－呋喃酸、苯甲酸、α－甲基丁酸、β－甲基戊酸和許多其它酸類[2～4]。煙草中的揮發(fā)性低級(jí)脂肪酸對(duì)卷煙香味有顯著影響，特別是戊酸、異戊酸和β－甲基戊酸，可賦予卷煙甜味、水果味和醇和的乳酪香味。因此，研究煙草中揮發(fā)性酸的種類對(duì)了解各種煙草內(nèi)在質(zhì)量和制定卷煙配方有重要指導(dǎo)意義。筆者應(yīng)用氣相色譜直接進(jìn)樣對(duì)目前常見的5種不同前處理方法水蒸氣蒸餾法、超聲波提取法、酸堿分離法、同時(shí)蒸餾萃取法以及同時(shí)蒸餾萃取和酸堿分離相結(jié)合的方法進(jìn)行了比較，并對(duì)云南4個(gè)產(chǎn)區(qū)(曲靖、昭通、文山和昆明)的云煙87的C3F初烤煙葉進(jìn)行分析，旨在找出煙草中揮發(fā)性有機(jī)酸的最佳提取和分離方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以湖南中煙工業(yè)公司提供的云煙87的C3F為材料，樣品分別取自云南的曲靖、昭通、文山和昆明。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水蒸汽蒸餾法[5]

取25 g煙樣置500 mL燒瓶中，加8倍量pH=1.5的磷酸浸泡24 h，水蒸餾裝置蒸餾，至餾出液達(dá)60 mL。然后分別用40 mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，濃縮至1 mL，進(jìn)行GC分析。

1.2.2 超聲波提取

取10 g煙葉置三角瓶中，加入50 mL pH=1.5的磷酸溶液，浸泡2 h，超聲處理30 min，濾過，濾液用20 mL二氯甲烷萃取3次，濃縮至1 mL，進(jìn)行GC分析。

1.2.3 酸堿分離法[6]

向裝有1.0 g煙末樣品的40 mL帶蓋試管中加入W(NaOH)=4%溶液10 mL，振蕩30 min后，冷凍揮干，加入W(H2SO4)=10%溶液10 mL，振蕩30 min后，再加入10 mL CH2Cl2振蕩60 min離心，分離兩相后，取出有機(jī)相，用無(wú)水Na2SO4脫水過濾，將濾液濃縮至1 mL，進(jìn)行GC分析。

1.2.4 同時(shí)蒸餾萃取過程(SDE)[7]

稱取25.0 g煙末，進(jìn)行同時(shí)蒸餾萃取。即將煙末置于萃取裝置一端的1 000 mL平底燒瓶中，加入350 mL水溶液，用電爐加熱。在裝置另一端的100 mL平底燒瓶中加入40 mL二氯甲烷，置于60℃的水浴中加熱，同時(shí)蒸餾萃取2 h，濃縮至1 mL，進(jìn)行GC分析。

1.2.5 同時(shí)蒸餾萃取+酸堿分離過程(SS)[8]

同時(shí)蒸餾萃取過程與上述一致。同時(shí)蒸餾萃取結(jié)束后，進(jìn)行酸堿分離，即把二氯甲烷溶液用25 mL4%的氫氧化鈉溶液洗滌3次，合并3次洗滌后的氫氧化鈉溶液，往其中緩緩加入15 mL20%的鹽酸溶液。然后分別用25 mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，濃縮至1 mL，進(jìn)行GC分析;

1.3 色譜條件

氣相色譜儀(意大利 finnigan)，F(xiàn)ID檢測(cè)器，分析柱:HP－FFAP(30 m×0.25 m mid×0.32 umdF);載氣為N2;恒流模式，流量1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度220℃;檢測(cè)器溫度:250℃;程序升溫:60℃ (1 min)——220℃(10 min)，2℃ /min;進(jìn)樣量 1 μL;不分流進(jìn)樣。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確量取乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、β－甲基戊酸、己酸、巴豆酸各10 μL，混合標(biāo)樣用二氯甲烷定容到10 mL，吸取1 mL，稀釋到5 mL。各標(biāo)樣的濃度見表1，標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖如圖1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度(單位:μg/mL)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同前處理方法的比較

試驗(yàn)過程中選用5種不同的前處理方法對(duì)揮發(fā)酸的提取進(jìn)行了比較，其結(jié)果如圖2～6。

由圖2可見，水蒸汽蒸餾法能提取出3種揮發(fā)酸，而且對(duì)己酸有很好的提取效果，但對(duì)于5碳以下的低分子量的脂肪酸提取效果較差。由圖3可見，超聲波提取操作簡(jiǎn)單，而且對(duì)于小分子的揮發(fā)酸有很好的提取效果，但對(duì)于5個(gè)碳以上的揮發(fā)酸提取效果明顯比水蒸氣蒸餾法差。由圖4可見，酸堿分離法對(duì)乙酸和戊酸的提取效果很好，但卻很難將其他成分提取出來(lái)。5種提取方法中以同時(shí)蒸餾萃取過程(SDE)和同時(shí)蒸餾萃取+酸堿分離過程(SS)效果最佳，但SDE處理提取的揮發(fā)酸含量明顯沒有SDE+SS過程的高，因此選擇同時(shí)蒸餾萃取+酸堿分離過程(SS)為最佳前處理方法。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖

圖2 水蒸汽蒸餾法譜圖

圖3 超聲波提取譜圖

圖4 酸堿分離法譜圖

圖5 同時(shí)蒸餾萃取過程(SDE)譜圖

圖6 同時(shí)蒸餾萃取+酸堿分離過程(SS)譜圖

2.2 工作曲線

準(zhǔn)確量取丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、β－甲基戊酸和己酸各10 μl，混合標(biāo)樣用二氯甲烷定容到10 mL，吸取1 mL，稀釋到5 mL，GC 分析，重復(fù)5次，采用平均相應(yīng)因素法做定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。從表2可知這6種標(biāo)樣都具有良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)均高于0.98。

表2 定量分析方法的線性方程、回收率和精密度

2.3 回收率

采用加標(biāo)法，即在煙草樣品中加入適量的混合標(biāo)樣，采用與煙草樣品前處理相同的實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)行定量計(jì)算。連續(xù)測(cè)定5組樣品后得到各有機(jī)酸的測(cè)定值，取平均值，按回收率(%)=[測(cè)定值(煙樣+標(biāo)樣)－測(cè)定值(煙樣)]/標(biāo)樣加入量×100，計(jì)算出各種揮發(fā)酸的回收率。表2數(shù)據(jù)結(jié)果表明，6種標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率均高于80%，可以用于煙草樣品揮發(fā)性有機(jī)酸的定量分析。

2.4 精密度

精密度試驗(yàn)，取同一個(gè)均勻煙葉樣品，按相同的前處理實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)行定量計(jì)算，連續(xù)測(cè)定5組樣品后，按下列公式求得變異系數(shù)。從表2中可以看出，6種定量組分的變異系數(shù)大多數(shù)控制在5%以內(nèi)，個(gè)別超過5%，最大的變異系數(shù)不超過8%，表明實(shí)驗(yàn)具有較好的重復(fù)性，結(jié)果可信。

2.5 樣品分析

采用同時(shí)蒸餾萃取加酸堿分離法，對(duì)云南4個(gè)產(chǎn)區(qū)云煙87中部葉煙草樣品進(jìn)行分析，定量分析結(jié)果如表3所示。該數(shù)據(jù)有較好的回收率和重復(fù)性，結(jié)果可信，比較適應(yīng)于煙草樣品揮發(fā)性有機(jī)酸的定性定量分析。

表3 云南烤煙中揮發(fā)性有機(jī)酸含量(μg/g)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在前處理方法選擇上，以同時(shí)蒸餾萃取+酸堿分離過程效果最佳。而其它4種方法不能作為揮發(fā)酸提取的前處理方法，主要是因?yàn)?(1)低分子量的脂肪酸的水溶性和揮發(fā)性較強(qiáng)，有機(jī)溶劑很難將其萃取完全，而且每次蒸餾出的水量將直接影響到揮發(fā)酸含量的穩(wěn)定性;(2)超聲和振蕩對(duì)樣品的破壞太小，部分揮發(fā)酸不能完全析出;(3)同時(shí)蒸餾萃取法雖克服了其他3種方法的缺陷，但煙葉樣品中成分復(fù)雜，揮發(fā)酸在揮發(fā)的同時(shí)揮發(fā)堿和其他成分，有可能酸和堿結(jié)合而影響揮發(fā)酸含量的測(cè)定，這也是本試驗(yàn)結(jié)果與李炎強(qiáng)等[9]研究結(jié)果不同的原因。

研究還表明，在定量分析上，6種標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率均高于80%，6種定量組分的變異系數(shù)除異丁酸和丁酸外，其他大多數(shù)控制在5%以內(nèi)，個(gè)別超過5%，最大的變異系數(shù)不超過8%，實(shí)驗(yàn)具有較好的重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可信的，可以用于煙草樣品揮發(fā)性、半揮發(fā)性有機(jī)酸的定量分析。

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