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    株兩優(yōu)819雜交制種的適宜收獲期研究

    2012-12-05 02:57:40舒志芬張海清
    作物研究 2012年6期
    關(guān)鍵詞:收獲期外滲母本

    舒志芬,劉 晨,張海清

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長沙410128)

    株兩優(yōu)819是株1S和華819所配制的兩系雜交組合。其母本株1S配合力強(qiáng),至2008年已配制并通過省級、國家級審定的雜交早稻組合有28個(gè),其中株兩優(yōu)02、株兩優(yōu)819、株兩優(yōu)30被評為省或國家廣適型超級雜交早稻組合,具有廣闊的推廣前景[1~3]。株1S所配雜交組合制種產(chǎn)量雖高(大面積制種產(chǎn)量達(dá)3 750 kg/hm2),但連續(xù)幾年來普遍反映所生產(chǎn)雜交種子發(fā)芽率較低,常給種子生產(chǎn)者和用種者帶來一定損失[4]。付愛斌等[5]認(rèn)為,陸兩優(yōu)996制種種子適宜收獲期在母本終花后第14~17天,該時(shí)期收獲的種子籽粒飽滿,成熟完全,物質(zhì)積累充分,發(fā)芽率(勢)高,種子電導(dǎo)率低,POD、CAT活性強(qiáng),種子活力高。王仁祥等[4]研究表明,株兩優(yōu)02和株兩優(yōu)819制種適時(shí)收獲期分別為母本終花后第11~16天、第12~17天。但上述試驗(yàn)都是在自由授粉條件下以獲得的種子批為研究對象,由于母本始花至終花需要經(jīng)歷較長時(shí)間,自由授粉會導(dǎo)致同一株母本不同小花接受花粉的時(shí)間差別較大,進(jìn)而導(dǎo)致同一批收獲的種子其成熟度可能存在較大差異,因而不能客觀反映種子本身的成熟度對種子活力的影響。筆者及課題組以株1S為母本、華819為父本,將用于制種的父母本進(jìn)行隔離避免其自由授粉,在盛花期對母本進(jìn)行集中授粉,以保證同批收獲的種子成熟度一致,進(jìn)而對不同收獲期的種子千粒重、發(fā)芽率、SOD酶及POD酶活性、外滲電解質(zhì)(H+、K+、可溶性糖)含量、淀粉含量等進(jìn)行測定,在保證種子發(fā)芽率和種子活性的情況下,以此確定株兩優(yōu)819種子的最佳收獲期,旨在為大田生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試雜交種為株兩優(yōu)819,母本為株1S,父本為華819。親本種子由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

    1.2 田間制種

    制種于2011年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長安教學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行。父本先播,母本于父本播后8 d播種,父母本行比2∶12,父母本分別于4.5葉齡左右移栽,母本每穴2~3株秧苗,株行距15 cm×20 cm。父本大雙行移栽,兩行間35 cm,株距15 cm,每穴5株,父母本間20 cm。母本見穗35%時(shí),連續(xù)2 d噴施“九二O”共240 g/hm2,并用薄膜將母本包圍與父本隔離,并在之后的第7天開始連續(xù)集中2 d人工授粉(9:00開始每間隔半小時(shí)授1次粉至16:00,次日重復(fù)操作)。母本授粉后的第10天起,連續(xù)16 d每2 d收獲1期種子,干燥至12.5%含水量,低溫貯藏備用。

    1.3 千粒重測定

    取1 000粒種子,稱出其重量,重復(fù)3次,取平均值。

    1.4 發(fā)芽率測定

    發(fā)芽床用濾紙做床紙,將兩片濾紙用蒸餾水浸透,放入無菌的發(fā)芽盒中,平放至濾紙間無氣泡。水稻種子在常溫下浸種24 h后,置于墊有兩層吸水紙的發(fā)芽盒中,每次取100粒種子,重復(fù)3次,置于30℃恒溫光照發(fā)芽箱內(nèi)培養(yǎng),每天對發(fā)芽種子計(jì)數(shù),至第7天結(jié)束,計(jì)算發(fā)芽率。

    1.5 保護(hù)酶系活性測定

    1.5.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

    酶液提取:取1.0 g吸脹種子,用液氮研磨成粉,加入5倍于樣品量的酶提取液0.2 mol/L磷酸二氫鈉在冰浴上研磨成勻漿。將勻漿在4℃下以12 000 r/min離心20 min,取其上清液。

    蛋白質(zhì)定量:用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定酶粗提取液的蛋白質(zhì)含量。

    (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取6支具塞試管,分別編號0~5,加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液和蒸餾水。向各支試管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,搖勻,放置5 min左右,在595 nm下比色測定吸光值。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    (2)樣品標(biāo)定:稱取0.5 g樣品,用5 mL蒸餾水或緩沖溶液研磨成勻漿后,以10 000 r/min離心10 min,吸取樣品上清液1.0 mL,放入具塞試管中,每個(gè)樣品重復(fù)2次,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,充分混合,放置2 min后在595 nm下比色,測定吸光值,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。

    式中:c—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量(μg);VT—提取液總體積(mL);VS—測定時(shí)加樣量(mL);mF—樣品質(zhì)量(g)[8]。

    酶活性的測定:取透明度好、質(zhì)地相同的試管2支,一支為對照組,將兩支試管中按比例(1∶1∶1)加入13 mmol/L甲硫氨酸溶液、75 μmol/L NBT溶液、10 μmol/L EDTA -Na,混合后,依次加入適量 20 μmol/L核黃素溶液和酶液,給對照管罩上比試管稍長的雙層黑色硬紙?zhí)妆芄猓磻?yīng)10~20 min,結(jié)束后,用黑布罩上試管,終止反應(yīng)。以遮光的對照管作為空白,用分光光度計(jì)在560 nm波長下測定各管的吸光值,計(jì)算SOD活性。

    式中:A0—遮光對照管的吸光值;AS—樣品管的吸光值;VT—樣液總體積(mL);V1—測定時(shí)樣品用量(mL);mF—鮮樣品質(zhì)量(g);c—粗酶液中的蛋白質(zhì)含量(mg/g)[7]。

    1.5.2 過氧化物酶(POD)活性測定

    粗酶液的提取:稱取1.0 g浸種3 d后的水稻種子,用9 mL pH=7.0的磷酸緩沖溶液研磨并轉(zhuǎn)移至離心管,于4 000 r/min離心15 min,收集上清液保存在冷處,所得殘?jiān)儆昧姿峋彌_液提取1次,合并兩次緩沖液,保存在4℃冰箱中。

    酶活性的測定:每個(gè)樣準(zhǔn)備兩個(gè)試管,測定管和對照管。測定管中依次加入2.9 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液、1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的H2O2、1.0 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚以及0.1 mL樣本上清液。反應(yīng)體系加入酶液后,立即于37℃水浴15 min,然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中,在470 nm下測量每分鐘吸光度變化值,以表示酶活性大小。對照管中用蒸餾水代替樣本上清液作為對照。3次重復(fù),計(jì)算POD酶活性。

    結(jié)果計(jì)算:以每分鐘OD470變化0.01為一個(gè)活性單位。

    式中:ΔOD470—每分鐘底物溶液吸光值的變化;m—材料質(zhì)量(mg)[7]。

    1.6 外滲電解質(zhì)的測定

    1.6.1 K+的測定

    取0.190 7 g的KCl(110℃烘2 h)溶于無離子水中,定容至1 L。吸取 100 ppmKCl標(biāo)液 2、4、6、8、10、12 mL于50 mL容量瓶中,用水定容。在火焰分光光度計(jì)上測定K+含量,制作K+標(biāo)準(zhǔn)曲線。取水稻種子5 g用無離子水25 mL浸種4 h后,吸取待測液2.5 mL定容至25 mL,取浸種液噴入火焰,記錄火焰光度計(jì)指針讀數(shù),重復(fù)3次,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的 K+的濃度[7]。

    1.6.2 H+的測定

    取5 g種子浸在25 mL無離子水中4 h,取其浸種液,把酸度計(jì)兩電極放入盛有浸種液的燒杯中,混合均勻,讀出浸種液的 pH[7]。

    1.6.3 可溶性糖外滲量的測定

    (1)200 mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取AR級D-葡萄糖200 mg,加蒸餾水定容至1 000 mL。

    (2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取6支試管編號1、2、3、4、5、6,分別在 6 支試管中加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,加水 2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 mL。然后在每支試管中加入0.5 mL蒽酮試劑,再用移液管加入5 mL濃H2SO4,搖勻,反應(yīng)10 min,在620 nm波長下比色,測定各管的吸光值。

    (3)吸取2 mL浸種液于大試管中,加入0.5 mL蒽酮試劑,再用移液管加入5 mL濃H2SO4,搖勻,反應(yīng)10 min,在620 nm波長下比色,測定各管的吸光值。

    (4)根據(jù)所測得光密度,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出糖含量(μg),計(jì)算浸種液的可溶性糖含量。可溶性糖濃度(μg/mL)為查圖所得糖含量(μg)/2 mL[7]。

    1.7 淀粉含量的測定

    (1)淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    取6支試管編號 1 ~6,分別加入 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL淀粉標(biāo)準(zhǔn)液。然后分別加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL 蒸餾水,搖勻,則每管依次含淀粉 0、40、80、120、160、200 μg。

    向每支試管中加入0.5 mL蒽酮試劑,再沿管壁加5.0 mL濃H2SO4,塞上塞子,微微搖動,促使乙酸乙酯水解,當(dāng)管內(nèi)出現(xiàn)蒽酮絮狀物時(shí),再劇烈搖晃促進(jìn)蒽酮溶解,然后立即放入沸水浴中加熱10 min,取出冷卻。

    在分光光度計(jì)上625 nm波長下比色,測出各管的吸光度。

    以吸光度值為橫坐標(biāo),淀粉含量為縱坐標(biāo),繪制淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線求得直線回歸方程。

    (2)樣品淀粉含量測定

    將種子放于70~80℃的烘箱中烘至恒溫,將種子磨成粉末,稱取50 mg,倒入10 mL試管中,加4 mL80%乙醇水浴鍋中不斷攪拌40 min,冷去后離心,倒掉上清液。再加2 mL80%的乙醇重新提取2次,過濾,將殘?jiān)娓伞?/p>

    將干燥的殘?jiān)?,移?0 mL容量瓶中,加20 mL蒸餾水,放入沸水浴中加熱15 min,再加入2 mL9.2 mol/L HClO4提取15 min,冷卻后用蒸餾水定容、搖勻。

    用濾紙過濾,濾液用來測定淀粉含量。

    吸取濾液0.5 mL放入小試管中加1.5 mL蒸餾水,加0.5 ml蒽酮試劑,然后沿管壁加5.0 mL濃H2SO4,塞上塞子,微微搖動,促使乙酸乙酯水解,當(dāng)管內(nèi)出現(xiàn)蒽酮絮狀物時(shí),再劇烈搖晃促進(jìn)蒽酮溶解,然后立即放入沸水浴中加熱10 min,取出冷卻,測出樣品在625 nm波長下的吸光度,通過直線回歸方程計(jì)算淀粉的含量[7]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同收獲期種子千粒重、發(fā)芽率和淀粉含量比較

    從表1可以看出,授粉后第10~26 d收獲的種子,隨著種子成熟度的提高,種子的千粒重、發(fā)芽率與淀粉含量逐步升高,至第8期達(dá)到最高,分別為20.67 g、96.33%、54.74 μg/g,而第 9 期略有下降。說明在第8期(授粉后第23~24 d)收獲的種子活力最高,第8期以前的種子仍在進(jìn)行物質(zhì)積累,沒有達(dá)到完全成熟,而第9期收獲的種子成熟過度,可能發(fā)生物質(zhì)淋溶情況,其淀粉含量、千粒重和發(fā)芽率均出現(xiàn)下降趨勢。

    表1 不同收獲期種子千粒重、發(fā)芽率和淀粉含量比較

    2.2 SOD酶活性與POD酶活性

    從圖1看出,第1期至第8期收獲的種子SOD酶活性呈現(xiàn)出緩慢增長的趨勢,在第8期酶活性達(dá)到最高,第9期略有降低。不同收獲期的種子POD酶活性總體呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢,第1期至第4期收獲的種子POD酶活性較低,第4期后收獲的種子POD酶活性快速增加,至第8期收獲的種子POD酶活性達(dá)到最高。由此可見,第8期收獲的種子抗逆性較強(qiáng),種子活力高。

    圖1 不同收獲期種子SOD酶與POD酶活性比較

    2.3 外滲電解質(zhì)

    從圖2可知,第1期至第8期收獲的種子,其外滲溶液中K+濃度總體上呈現(xiàn)出下降趨勢,但是在第9期收獲的種子其濃度稍有上升,說明成熟度差的種子細(xì)胞完整性差、透性大,浸泡液中低分子物質(zhì)含量較多,因而外滲電解質(zhì)濃度高。隨著種子成熟度的提高,種子的外滲電解質(zhì)濃度逐漸降低。在第9期收獲的種子成熟過度,導(dǎo)致收獲的種子細(xì)胞膜受損,K+濃度略有上升。

    第1期至第7期收獲的種子pH值呈現(xiàn)上升的趨勢,即外滲電解質(zhì)溶液中H+濃度呈現(xiàn)下降趨勢,但第8期與第9期收獲的種子pH值呈現(xiàn)下降趨勢,即H+濃度開始增加,說明第7期與第8期收獲的種子細(xì)胞完整性好,種子活力高。

    圖2 不同收獲期種子外滲電解質(zhì)及可溶性糖濃度比較

    2.4 可溶性糖含量比較

    隨著種子成熟度的增加,種子中的可溶性糖會不斷轉(zhuǎn)換成不溶性的淀粉貯藏在種子中。從圖2還可以看出,第1期至第4期收獲的種子的可溶性糖含量呈現(xiàn)緩慢下降趨勢,第5期收獲的種子可溶性糖含量快速下降,之后收獲的種子可溶性糖含量保持穩(wěn)定,但是在第9期收獲的種子其含量呈現(xiàn)略微增加。

    3 小結(jié)與討論

    研究結(jié)果表明,在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9個(gè)收獲期內(nèi),以第8期收獲的種子發(fā)芽率最高,其種子的千粒重和淀粉含量也最高,說明在此時(shí)期收獲的種子成熟度高,物質(zhì)積累充分。從酶活性測定結(jié)果來看,在第8期收獲的種子SOD酶與POD酶活性最高。種子的外滲電解質(zhì)濃度與種子的活力呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,第8期收獲的種子的外滲電解質(zhì)濃度較低,種子細(xì)胞膜的完整性好,透性小,這期間收獲的種子具有較高的活力。因此,株兩優(yōu)819制種在第1至第7期收獲的種子未完全成熟,處于物質(zhì)逐漸積累和種子活力逐步提高的階段,至第8期收獲的種子已經(jīng)成熟完全,種子的千粒重和淀粉含量達(dá)到最高,種子發(fā)芽率也達(dá)到最高,種子活力和抗逆性最強(qiáng)。第9期收獲的種子成熟過渡,出現(xiàn)物質(zhì)外滲現(xiàn)象,種子活力下降,發(fā)芽率降低。說明株兩優(yōu)819制種最佳的收獲期是在第8期,即母本授粉后第23~24 d。

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