Cox-2/PGE-2及IL-6在Wnt/β連環(huán)蛋白-骨代謝信號通路中的作用機(jī)制

鮑捷 王國祥

1 蘇州大學(xué)體育學(xué)院運(yùn)動人體科學(xué)系（蘇州 215021）

2 蘇州大學(xué)捷美生物醫(yī)學(xué)工程儀器聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路在Wnt信號通路中最為經(jīng)典，其對應(yīng)力刺激敏感，能夠?qū)C(jī)械信號轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號，并對OPG/RANKL/RANK骨代謝信號進(jìn)行調(diào)控[1]。COX-2/PGE-2作為Wnt/β連環(huán)蛋白信號對骨代謝信號通路調(diào)控的中間途徑，同時(shí)也作為獨(dú)立的一個信號存在，對應(yīng)力刺激敏感，在整個信號通路中起到重要的作用[2]。細(xì)胞因子白介素6（IL-6）對運(yùn)動應(yīng)激敏感，可以影響COX-2活性，與PGE-2共同作為Wnt/β連環(huán)蛋白信號-COX-2/PGE-2-OPG/RANKL/RANK信號鏈的正反饋信號[3]，可以解釋機(jī)體應(yīng)激條件下的過度運(yùn)動應(yīng)力促骨細(xì)胞及形態(tài)學(xué)改變致骨損傷易感性增高的機(jī)理。

1 COX-2/PGE-2與應(yīng)力刺激

環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）是游離花生四烯酸合成前列腺素（prostaglandin，PG）和血栓素的限速酶，包括COX-1和COX-2兩種亞型。COX-1在大多數(shù)正常細(xì)胞中呈穩(wěn)定表達(dá)狀態(tài)，維持正常的生理功能，而COX-2是誘導(dǎo)應(yīng)激性表達(dá)基因，在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)迅速合成，參與應(yīng)激過程，在多種炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中常見[4-6]。COX-2主要定位于細(xì)胞的核膜，其產(chǎn)生的PG可以直接進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。PG是存在于動物和人體內(nèi)的一類不飽和脂肪酸組成的具有多種生理活性的物質(zhì)，在人體內(nèi)由花生四烯酸合成，由一個五環(huán)和兩條側(cè)鏈構(gòu)成，分為A～I(xiàn)等9個類型。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)選擇性上調(diào)COX-2，使其持續(xù)表達(dá)，可促PG持續(xù)分泌[7]。PGE-2通過特異性受體介導(dǎo)完成對骨組織代謝的調(diào)節(jié)，在骨代謝中具有雙向調(diào)節(jié)作用，有劑量依賴性。使用3μM的PGE-2對血清培養(yǎng)基中的3～5個/視野的成骨細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，每視野下成骨細(xì)胞數(shù)目增殖至10～15個；在使用western-blot法測試PGE-2對膠原纖維蛋白水平表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，同樣發(fā)現(xiàn)膠原纖維蛋白水平無論從PGE-2的刺激時(shí)間還是刺激濃度上都有顯著的依賴性[8]。Somayaji等在對成骨細(xì)胞培養(yǎng)過程中，加入COX-2的抑制劑NS-398后發(fā)現(xiàn)，加抑制劑組PGE-2含量遠(yuǎn)低于對照組，RANKL蛋白水平顯著下降。此外，還有更多的研究表明低濃度的PGE-2促成骨細(xì)胞膠原纖維合成，高濃度PGE-2參與骨的吸收過程，其劑量受COX-2的調(diào)節(jié)[9-11]。

在牙科學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，COX-2/PGE-2對炎癥和應(yīng)力刺激敏感，牙周炎組的COX-2、PGE-2水平較健康組顯著升高，而牙齒矯形領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械牽張力促COX-2，PGE-2水平升高，且升高水平與NF-κB受體活化因子配體（ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL）成正相關(guān)。RANKL由成骨/基質(zhì)細(xì)胞分泌，在1,25（OH）2D3、PTH和IL-11輔助作用下，可以被前破骨細(xì)胞識別并通過該分子與成骨/基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生作用，繼而分化為破骨細(xì)胞（osteoclast，OC），其在體外能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）膠原纖維的生成，在體內(nèi)能促進(jìn)骨吸收[12，13]。將骨髓培養(yǎng)細(xì)胞放入重組sRANKL環(huán)境，發(fā)現(xiàn)其在沒有成骨/基質(zhì)細(xì)胞條件下分化為OC。當(dāng)給小鼠注射sRANKL后也發(fā)現(xiàn)OC數(shù)量增多，骨吸收活躍，血鈣升高[14]，表明RANKL除了刺激OC分化成熟，還能活化OC，增強(qiáng)OC的功能。多個實(shí)驗(yàn)表明，PGE-2通過刺激OB細(xì)胞中RANKL的表達(dá)，調(diào)節(jié)OC活性和分化[15-17]（圖 1）。

圖1 COX-2/PGE-2/RANKL信號通路的作用機(jī)制

近年來應(yīng)力刺激對COX-2/PGE-2水平上調(diào)的作用廣受關(guān)注，相關(guān)研究試圖解釋運(yùn)動應(yīng)力對骨健康的雙向調(diào)節(jié)機(jī)制[18]。研究發(fā)現(xiàn)，力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號并不直接引起COX-2水平的上調(diào)，而是通過細(xì)胞間隙結(jié)構(gòu)-分子信號轉(zhuǎn)換作用實(shí)現(xiàn)。鈣粘附蛋白是一個介導(dǎo)細(xì)胞間黏附聚集和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的家族，在不同的組織，分布有E-鈣粘附蛋白、N-鈣粘附蛋白、P-鈣粘附蛋白等三種類型。鈣粘附蛋白分子的胞漿區(qū)高度保守，并與細(xì)胞內(nèi)骨架相連，在包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的很多種細(xì)胞里存在。鈣粘附蛋白作為一種跨膜的鈣依賴性黏附分子，在細(xì)胞膜上直接與β-連環(huán)蛋白結(jié)合形成一個復(fù)合體，它把β-連環(huán)蛋白隔離于細(xì)胞膜上，阻止β-連環(huán)蛋白向胞漿及胞核轉(zhuǎn)位，發(fā)揮其調(diào)控下游基因表達(dá)的作用[19]。Adkison等給鼠肺動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞施加34%的牽張應(yīng)力24 h后發(fā)現(xiàn)，與β-連環(huán)蛋白結(jié)合的E-鈣粘附蛋白明顯減少[20]。采用細(xì)胞形態(tài)與生物學(xué)、分子生物學(xué)等多種研究手段探討牽張應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的變化和作用發(fā)現(xiàn)，牽張應(yīng)力可以激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號，促進(jìn)GSK-3β復(fù)合物解體，游離β-連環(huán)蛋白增多，GSK-3β與和E-鈣粘附蛋白結(jié)合的β-連環(huán)蛋白結(jié)合后促β-連環(huán)蛋白脫離E-鈣粘附蛋白后降解，無β-連環(huán)蛋白結(jié)合的E-鈣粘附蛋白則引起細(xì)胞骨架的變化，而從GSK-3β復(fù)合物脫落的β-連環(huán)蛋白入核后與Tcf/Lef結(jié)合，促下游目的基因COX-2、c-Fos、c-Jun等表達(dá)，β-連環(huán)蛋白在這個過程中發(fā)揮著重要的樞紐作用。成骨細(xì)胞胞膜上的β-連環(huán)蛋白/E-粘附蛋白復(fù)合體在牽張力的作用下解聚并引起β-連環(huán)蛋白入核則可能是機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)在機(jī)制之一[21]。細(xì)胞骨架的松散及COX-2/PGE-2大量生成，通過RANKL的促破骨細(xì)胞活性作用致骨結(jié)構(gòu)改變，骨強(qiáng)度下降，從而使骨損傷易感性增高（圖2）。

2 IL-6與運(yùn)動應(yīng)激

圖2 -連環(huán)蛋白-E-鈣粘附蛋白復(fù)合物與細(xì)胞骨架鏈接結(jié)構(gòu)

白細(xì)胞介素（interleukin，IL）是一組由多種細(xì)胞產(chǎn)生的介導(dǎo)細(xì)胞之間相互作用的細(xì)胞因子。IL-6是白介素家族的一類具有促炎抗炎及對運(yùn)動應(yīng)激敏感的細(xì)胞因子，在炎癥時(shí)由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，促進(jìn)創(chuàng)傷部位免疫反應(yīng)。IL-6通過對TNF-α和IL-1的抑制以及對IL-1Ra和IL-10的激活實(shí)現(xiàn)抗炎作用。運(yùn)動應(yīng)激狀態(tài)下肌肉收縮，肌組織分泌IL-6，并在血循環(huán)中提前于其他細(xì)胞因子出現(xiàn)。多數(shù)組織IL-6會在運(yùn)動應(yīng)激狀態(tài)下升高，升高程度與運(yùn)動強(qiáng)度、運(yùn)動量及運(yùn)動方式密切相關(guān)[22，23]，有研究發(fā)現(xiàn)肌肉離心運(yùn)動時(shí)產(chǎn)生IL-6顯著高于向心運(yùn)動[24]。而在對大鼠進(jìn)行6周遞增負(fù)荷的研究中，由于大鼠免疫應(yīng)激的適應(yīng)過程導(dǎo)致血清IL-6比較平穩(wěn)，說明IL-6與機(jī)體對運(yùn)動量或強(qiáng)度的不適應(yīng)所導(dǎo)致的應(yīng)激相關(guān)，而逐步遞增的適應(yīng)性負(fù)荷不易引起 IL-6的變化[25]。

IL-6作為研究最完善的細(xì)胞因子之一，其通過與IL-6R結(jié)合后再與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)亞單位gp130結(jié)合，從而調(diào)節(jié)IL-6的生物功能[26]。gp130 是糖蛋白，也是重要的受體復(fù)合物信號調(diào)節(jié)元件，受到細(xì)胞因子刺激后，gp130發(fā)生二聚化，與gp130近膜端連接的非受體型的酪氨酸激酶（Janus kinase，JAK）被激活，從而啟動一系列信號轉(zhuǎn)錄[27]。信號傳遞轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transduction and activation of transcription，STAT）是一類信息傳遞與轉(zhuǎn)錄激活蛋白，其主要功能是促進(jìn)信息核轉(zhuǎn)移[28]，JAK信號對其酪氨酸磷酸化后轉(zhuǎn)移入核，并激活下游基因表達(dá)[29]。JAK/STAT通路是IL-6參與應(yīng)激反應(yīng)的細(xì)胞因子傳導(dǎo)信號的重要途徑，其可被EPO、IL-3、G-CSF、IL-6等多種細(xì)胞因子刺激所激活，可能是這些不同的細(xì)胞因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個共同因素，這種與受體相聯(lián)的JAK激酶可能因受體結(jié)構(gòu)的不同而催化不同的底物，使JAK介導(dǎo)許多不同的生物學(xué)功能[30]。

在成骨細(xì)胞內(nèi)，RANKL基因的表達(dá)嚴(yán)格地受一些促骨因子的調(diào)節(jié)，包括1，25（OH）2D3，甲狀旁腺激素，還有細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-11等。IL-6與細(xì)胞膜上的gp130發(fā)生二聚化以后，激活酪氨酸激酶JAK，隨后激活的JAK對STAT磷酸化，STAT3蛋白抑制分子PIAS3解離，被磷酸化的STAT入核，并促進(jìn)RANKL的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟[31，32]（圖 3）。

圖3 IL-6的JAK/STAT3途徑直接對RANKL的影響（Tomohiro H，Takaishi H，Takito J，et al. Blood，2009[32]）

除此以外，IL-6通過與gp130二聚化后，通過激活JAK促進(jìn)磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）磷酸化，后通過蛋白激酶（Akt）途徑，激活MAPK；另一條通路是JAK和Ras結(jié)合，促Ras/MAPK通路激活，從而促破骨細(xì)胞活性[33，34]。（圖 4）

圖4 IL-6與gp130二聚化后的其他信號通路（Steeve KT，Marc P，Sandrine T，et al. Cytokine and Growth Factor Reviews，2004[38]）

近年研究認(rèn)為IL-6與COX-2的調(diào)節(jié)過程密切相關(guān)，其機(jī)制涉及運(yùn)動干預(yù)、受體免疫、信號激活等多個方面[35，36]。IL-6由單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞分泌，刺激骨組織中成骨細(xì)胞進(jìn)一步分泌IL-6，從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和成熟[37，38]。

3 COX2/PGE-2與IL-6在Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路中的作用

COX-2/PGE-2/RANKL是骨吸收的重要信號之一，其同時(shí)作為Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路的下游信號，參與對OPG/RANKL/RANK骨代謝信號調(diào)控。

骨骼系統(tǒng)的發(fā)育對運(yùn)動應(yīng)力敏感，并在運(yùn)動應(yīng)力的刺激下不斷地進(jìn)行生理重塑。骨的重塑受骨細(xì)胞系活性影響，其中最主要的就是成骨細(xì)胞（osteoblasts），骨細(xì)胞（osteocytes）及破骨細(xì)胞（osteoclasts）。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在時(shí)間和空間上有很近的聯(lián)系，當(dāng)獲得一個刺激信號（負(fù)荷、激素或生長因子），破骨細(xì)胞出現(xiàn)在骨的表面，并通過細(xì)胞外酸溶機(jī)制吸收骨的礦物成分[39]。

Wnt/β連環(huán)蛋白信號對骨形成和骨量起到直接作用，目前被看作骨質(zhì)疏松發(fā)生最重要因素之一[40，41]。其中 Lrp5 作為 Wnt的輔助受體，Wnt/Lrp5信號是骨合成的重要信號[42，43]，通過Wnt/β連環(huán)蛋白信號刺激可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化，并誘導(dǎo)抑制脂質(zhì)細(xì)胞[44，45]，部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其機(jī)制為與骨形成蛋白、甲狀旁腺素信號互相作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞基因表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞生長[46-48]。

John給大鼠連續(xù)使用GSK-3β抑制劑（GSK-3βi），同時(shí)對大鼠活體脛骨固定后施4點(diǎn)彎曲力2周后發(fā)現(xiàn)，使用GSK-3βi的大鼠COX-2、eNOS、Wnt10B、FzD2等基因表達(dá)顯著增加，其中COX-2表達(dá)是對照組的28倍[49]。在對MC3T3-E1細(xì)胞5小時(shí)內(nèi)采用微壓力系統(tǒng)加力3400次發(fā)現(xiàn)，COX-2和eNOS基因表達(dá)增加2.5倍，與c-fos和c-jun基因表達(dá)增加（3.5倍）相關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)表明COX2、eNOS、c-fos和c-jun都是對壓力敏感基因，且通過用GSK-3βi的實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些基因與Wnt/β連環(huán)蛋白信號相關(guān)，且屬于Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路轉(zhuǎn)換的生物化學(xué)信號的一部分。Sawakami在LRP5基因缺失的成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)流體力學(xué)刺激增加PGE-2的釋放，從而驗(yàn)證了PGE-2信號與Wnt/β連環(huán)蛋白信號對于力學(xué)刺激的感應(yīng)與LRP5無關(guān)[50]。在使用機(jī)械應(yīng)力進(jìn)行體內(nèi)外的刺激的實(shí)驗(yàn)表明，Wnt/β連環(huán)蛋白信號的激活，包括脂肪生成抑制基因Wnt10B的表達(dá)，可以誘導(dǎo)COX2、eNOS、c-fos和c-jun等基因的表達(dá)，也有人認(rèn)為這是機(jī)械力刺激與Wnt/β連環(huán)蛋白信號協(xié)同刺激的結(jié)果[51，52]。

有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌的發(fā)生過程中COX-2與Wnt/β連環(huán)蛋白信號有著高相關(guān)性，并在信號通路共同路徑中相互影響[53]。而PGE-2的升高能通過3個途徑介導(dǎo)，促進(jìn)入核與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（Tcf/Lef）的活性，從而使得COX-2基因表達(dá)進(jìn)一步加強(qiáng)。其機(jī)制在于:（1）PGE-2與G雙蛋白受體（GPR）結(jié)合直接影響Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路軸蛋白（Axin）結(jié)合復(fù)合物能力，使β-連環(huán)蛋白結(jié)合細(xì)胞膜上的E-鈣黏蛋白（E-cadherin），軸蛋白（Axin）、酪蛋白激酶（casein kinase，CK）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的巨大復(fù)合物解體，β連環(huán)蛋白游離入核與Tcf/Lef作用。（2）PGE-2與GFR的復(fù)合物通過磷酸蛋白激酶A（PKA）-cAMP旁路直接激活 Tcf/Lef的活性[54]。（3）PGE-2與 GPR 的復(fù)合物與生長因子受體（growth factor receptors，GFR）進(jìn)一步結(jié)合，通過磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）途徑介導(dǎo)β連環(huán)蛋白的去磷酸化并促進(jìn)其入核。（4）PGE-2與GFR的復(fù)合物與生長因子受體（growth factor receptors，GFR）進(jìn)一步結(jié)合，通過Ras/MAPK途徑促Tcf/Lef的活性[55（]圖5）。由此可見，在持續(xù)應(yīng)力刺激的情況下，Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路對COX-2/PGE-2的促生成呈正反饋趨勢，導(dǎo)致PGE-2濃度持續(xù)升高，刺激成骨細(xì)胞的RANKL大量分泌并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。PEG-2的正反饋積累效應(yīng)也解釋了長期持續(xù)應(yīng)力作用下致骨細(xì)胞及形態(tài)學(xué)變化使骨損傷易感性增高的機(jī)制。

圖5 IL-6、COX-2/PGE-2在Wnt/連環(huán)蛋白信號通路中的相互作用

運(yùn)動應(yīng)激產(chǎn)生的IL-6與gp130形成二聚體后，一方面通過Jak/STAT機(jī)制促RANKL直接分泌，另一方面通過Jak促PI3K/Akt途徑及ras/MAPK途徑，與PGE-2形成了共刺激信號，共同促進(jìn)β連環(huán)蛋白的入核及細(xì)胞核內(nèi)Tcf/Lef的活性。同時(shí)，IL-6促進(jìn)PGE-2大量生成也進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌IL-6，也形成了運(yùn)動應(yīng)激的正反饋機(jī)制。持續(xù)運(yùn)動應(yīng)力刺激必然產(chǎn)生持續(xù)運(yùn)動應(yīng)激，當(dāng)機(jī)體在應(yīng)激過程中打開免疫窗口，IL-6的正反饋機(jī)制與應(yīng)力刺激的PEG-2正反饋積累效應(yīng)相互促進(jìn)，共同抑制成骨細(xì)胞的活性，并促進(jìn)破骨細(xì)胞功能，使骨形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，應(yīng)力致骨損傷易感性增高。

4 小結(jié)與展望

COX-2/PGE-2是Wnt/β連環(huán)蛋白信號對骨代謝信號調(diào)控通路的中間途徑，其通過Wnt/β連環(huán)蛋白，將力學(xué)信號轉(zhuǎn)換為生物信號的機(jī)制，對OPG/RANKL/RANK骨代謝信號進(jìn)行調(diào)控，其研究目前多集中在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是否能在運(yùn)動醫(yī)學(xué)的骨損傷領(lǐng)域運(yùn)用，尚需研究。IL-6是運(yùn)動應(yīng)激下多組織分泌的細(xì)胞因子，在運(yùn)動時(shí)伴隨運(yùn)動應(yīng)力的刺激使COX-2/PGE-2與IL-6系統(tǒng)同時(shí)激活，PGE-2與IL-6是一對能夠相互影響的共刺激信號，分別通過其共同及獨(dú)有的分子信號鏈對Wnt/β連環(huán)蛋白信號進(jìn)行正反饋調(diào)節(jié)，通過從口腔醫(yī)學(xué)及其他醫(yī)學(xué)學(xué)科基礎(chǔ)與臨床實(shí)驗(yàn)中總結(jié)PGE-2與IL-6的正反饋積累效應(yīng)，可嘗試解釋過度應(yīng)力刺激及應(yīng)激狀態(tài)下骨細(xì)胞代謝及骨形態(tài)改變，使骨損傷易感性增高的機(jī)制，但應(yīng)力是否促骨損傷尚無相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，值得進(jìn)一步研究。

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