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    半月板纖維軟骨細(xì)胞與殼聚糖/聚磷酸鈣體外復(fù)合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

    2012-11-17 11:21:48付維力王踐云李箭萬(wàn)昌秀葉京兵羅大輝李棋
    關(guān)鍵詞:殼聚糖支架生物

    付維力 王踐云 李箭 萬(wàn)昌秀 葉京兵 羅大輝 李棋

    1 四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科(成都 610041) 2 四川大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)院

    近年來(lái),利用組織工程原理和技術(shù)重建嚴(yán)重?fù)p傷的半月板或治療半月板缺失的患者,已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1-6]。目前,應(yīng)用于組織工程半月板的支架材料還處于廣泛的篩選和試驗(yàn)階段,而單一的無(wú)機(jī)材料和單一的有機(jī)材料均難以滿足臨床對(duì)組織工程半月板的生物活性及生物力學(xué)性能的綜合要求。如何結(jié)合天然和合成、有機(jī)和無(wú)機(jī)支架材料的各自優(yōu)點(diǎn),構(gòu)建符合組織工程半月板要求的復(fù)合材料,是目前支架材料的研究熱點(diǎn)[7]。殼聚糖(chitosan,CS)具有良好的生物相容性和可調(diào)節(jié)的生物降解性能,其結(jié)構(gòu)單元氨基葡萄糖與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中蛋白多糖分子鏈的結(jié)構(gòu)單元糖胺聚糖相似。它屬于pH依賴性陽(yáng)離子聚合物,可與陰離子反應(yīng)生成聚電解質(zhì)配合物而具多重生物活性,其單體上的氨基基團(tuán)可作為活性基團(tuán)與醛基反應(yīng)。但其缺點(diǎn)是力學(xué)強(qiáng)度不夠。而聚磷酸鈣(calcium polyphosphate,CPP)具有良好的生物相容性和良好的化學(xué)穩(wěn)定性,并具備優(yōu)良的力學(xué)性能。殼聚糖與聚磷酸鈣兩者復(fù)合可以取長(zhǎng)補(bǔ)短,提高其力學(xué)強(qiáng)度和生物相容性。因傳統(tǒng)交聯(lián)劑如戊二醛、乙二胺等隨著材料降解逐漸出現(xiàn)毒副作用,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)復(fù)合支架材料的降解和交聯(lián)劑的選擇等問(wèn)題,探索了一種天然材料海藻酸鈉來(lái)源研制的新型生物交聯(lián)劑醛基化海藻酸鈉(aldehyde alginate,ADA)[8,9],在此基礎(chǔ)上,采用化學(xué)交聯(lián)固化法將CS、ADA和CPP有機(jī)地結(jié)合起來(lái),制備一種新型多孔半月板組織工程支架材料;通過(guò)觀察半月板細(xì)胞在不同配比CS/CPP支架材料上的生長(zhǎng)、增殖狀況,為支架材料探索最佳的CS/CPP比例,為組織工程半月板支架材料的優(yōu)選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)健康1周齡新西蘭乳兔,雌雄不限,約200~300 g,由四川大學(xué)華西動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。1:1 DMEM/F12(DF)、FBS、胰蛋白酶、EDTA、Ⅱ型膠原酶(Sigma公司,美國(guó));CO2培養(yǎng)箱(SANYO公司,日本);離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó)),倒置相差顯微鏡(Olympus公司,日本),掃描電鏡(JSM-6700F,JEOL,日本);鼠抗兔Ⅰ型膠原單克隆抗體、鼠抗兔Ⅱ型膠原單克隆抗體(Oncogene公司,美國(guó));SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);碳酸鈣、磷酸、高碘酸鈉(分析純,成都科龍化工試劑廠);海藻酸鈉(分析純,浙江晶巖生物有限公司);殼聚糖(醫(yī)用級(jí),浙江澳興生物有限公司)。

    1.2 半月板纖維軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)

    無(wú)菌條件下取1周齡新西蘭乳兔雙膝內(nèi)外側(cè)半月板,放入盛有DF培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,用含1%慶大霉素的PBS沖洗3遍,剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎塊,然后用0.25%胰蛋白酶37℃預(yù)消化30 min,再加入0.2%Ⅱ型膠原酶37℃恒溫水浴搖床振蕩消化4~6 h。經(jīng)顯微鏡觀察,大部分細(xì)胞消化下來(lái)后,用巴氏吸管吹打2 min,終止消化,用200目篩網(wǎng)過(guò)濾消化后的細(xì)胞懸液,1.2k r/min離心5 min,棄上清,PBS洗兩次,細(xì)胞按1×106/瓶重懸于含10%FBS的DF培養(yǎng)基的底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換液1次,隔日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞鋪滿瓶底(80%~90%融合)后,用含0.1%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化傳代。通過(guò)細(xì)胞化學(xué)(HE染色、甲苯胺藍(lán)、番紅O)、Ⅰ型和Ⅱ型膠原免疫組化對(duì)體外培養(yǎng)的半月板細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定,取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.3 殼聚糖/聚磷酸鈣復(fù)合支架材料的制備

    稱取質(zhì)量比例分別為10:0、7:3、5:5、3:7的CS、CPP,分別溶入醋酸溶液和無(wú)水乙醇,共混加熱攪拌制備成均一的CS/CPP混合物,加入ADA溶液交聯(lián),高速攪拌2 min。迅速將制備的CPP/CS/ADA凝膠轉(zhuǎn)入到模具中,將填有凝膠混合物的模具轉(zhuǎn)入冰箱中,于-20℃冷凍4 h,使固液相分離。之后使用冷凍干燥機(jī)于壓力為0.5 mmHg、-5℃條件下干燥24 h,以完全除去溶劑。干燥完畢后,即得到不同CS/CPP比例的復(fù)合多孔支架。取制備的不同配比CS/CPP三維多孔支架,樣品表面噴鉑金處理后,于掃描電鏡下觀察樣品的結(jié)構(gòu)形貌,通過(guò)排液法測(cè)定支架的孔隙率。取三維多孔支架(直徑5 mm,高3 mm)分別加入6孔板內(nèi),封口后經(jīng)Co-60 射線(照射總劑量為25KGy)消毒后備用。

    1.4 組織工程化半月板的體外復(fù)合培養(yǎng)

    取單層培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好的第三代半月板纖維軟骨細(xì)胞,經(jīng)0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA按1:1混合酶消化,收集細(xì)胞,制備2×107/ml密度的細(xì)胞懸液。用10 μl的微量移液槍將細(xì)胞懸液以10 μl/材料樣品緩慢均勻滴加于材料上,然后放于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h,使細(xì)胞粘附到材料中。再將剩下的細(xì)胞滴加到材料上,并于材料底部滴加10μl培養(yǎng)基保濕,置于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h,使接種的半月板細(xì)胞第二次沉淀到支架上,緩慢從材料旁邊加入含10%FBS的DF培養(yǎng)液進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。隔日換液,體外復(fù)合培養(yǎng)7 d。

    1.5 觀察指標(biāo)

    形態(tài)學(xué)觀察:復(fù)合后,隔日于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞在支架材料上的生長(zhǎng)和粘附情況。

    組織學(xué)染色觀察:復(fù)合培養(yǎng)7 d后,各取一塊不同配比的材料于4%多聚甲醛中固定,梯度酒精脫水,二甲苯透明,常規(guī)石蠟包埋,5 μm切片,行HE組織化學(xué)染色,光鏡下觀察。

    掃描電鏡觀察:復(fù)合培養(yǎng)7 d后取出標(biāo)本,分別取一塊不同配比的材料PBS漂洗,2.5%戊二醛固定2 h,PBS沖洗,梯度乙醇上行脫水,醋酸異戊酯保存,CO2干燥器干燥、噴金、黏托,掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的生長(zhǎng)情況。

    2 結(jié)果

    2.1 半月板纖維軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)觀察(圖1)

    半月板纖維軟骨細(xì)胞原代接種后8 h有少量細(xì)胞開(kāi)始貼壁,48~72 h多數(shù)細(xì)胞貼壁完全,胞質(zhì)逐漸展開(kāi),細(xì)胞變大伸長(zhǎng),形成突起,呈多角形,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,輪廓清晰,鏡下觀察有立體感,出現(xiàn)明顯的集落樣分區(qū),表現(xiàn)“細(xì)胞群聚”現(xiàn)象,7~9 d后,細(xì)胞長(zhǎng)滿傳代。傳代后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力和增殖速度明顯加快。第2代后細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始逐漸變?yōu)樗笮危?代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,增殖減緩。細(xì)胞HE染色、甲苯胺藍(lán)、番紅O和免疫組化染色顯示:體外分離培養(yǎng)的第3代半月板細(xì)胞Ⅰ型和Ⅱ型膠原均表達(dá)陽(yáng)性,并分泌蛋白聚糖,其基本維持半月板纖維軟骨細(xì)胞的表型。

    2.2 支架材料的檢測(cè)

    掃描電鏡下觀察可見(jiàn):孔徑大小和分布較均勻,并且相互貫通,孔徑分布在200~500 μm之間(圖2)。通過(guò)排液法測(cè)定支架的孔隙率在75%~86%之間。使用ADA交聯(lián)制備出的復(fù)合支架生物材料具有較高的孔隙率和孔徑。

    2.3 半月板纖維軟骨細(xì)胞與殼聚糖/聚磷酸鈣體外復(fù)合培養(yǎng)觀察

    2.3.1 倒置相差顯微鏡觀察

    半月板纖維軟骨細(xì)胞接種后呈球形,黏附于多孔支架邊緣,培養(yǎng)液中可見(jiàn)少量懸浮細(xì)胞,1 h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁,4 h后大部分細(xì)胞貼壁完全,呈短梭形或多角形,形態(tài)規(guī)則;3~5 d后可見(jiàn)細(xì)胞在支架上黏附良好,支架孔隙逐漸被細(xì)胞以及分泌的基質(zhì)填滿,細(xì)胞支架復(fù)合體輪廓逐漸明顯。

    2.3.2 HE染色

    HE染色(圖3)可見(jiàn):半月板軟骨細(xì)胞粘附于支架材料上,呈梭形或多角形,胞漿紅染,細(xì)胞核呈圓形或者卵圓形??梢?jiàn)核仁和細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞可見(jiàn)分裂相。孔洞內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng),并有基質(zhì)分泌。

    2.3.3 掃描電鏡觀察

    掃描電鏡觀察(圖4)可見(jiàn),復(fù)合培養(yǎng)7 d,細(xì)胞在支架上均勻分布,緊貼支架上生長(zhǎng),細(xì)胞多數(shù)呈多角形,形態(tài)規(guī)則,大小均一,立體感強(qiáng),可見(jiàn)大量基質(zhì)分泌。其中3:7的CS/CPP支架材料上,半月板細(xì)胞生長(zhǎng)良好,數(shù)目最多,接近覆蓋整個(gè)支架表面,生長(zhǎng)極其旺盛,連接緊密,融合成片,細(xì)胞外基質(zhì)分泌也最多。

    3 討論

    3.1 半月板纖維軟骨細(xì)胞的鑒定

    圖1 MFCs形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)和免疫組化染色觀察(倒置相差顯微鏡×200)

    圖2 掃描電鏡觀察不同比例CS/CPP復(fù)合三維多孔支架(×1200)

    圖3 MFCs與不同比例CS/CPP復(fù)合培養(yǎng)7d組織學(xué)觀察(HE×200)

    圖4 MFCs與不同比例CS/CPP復(fù)合培養(yǎng)7d掃描電鏡觀察(×1200)

    對(duì)于將半月板細(xì)胞歸類(lèi)于軟骨細(xì)胞還是成纖維細(xì)胞,一直存在爭(zhēng)議。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),半月板組織包含成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和軟骨細(xì)胞兩種細(xì)胞亞型,因此認(rèn)為將其稱為纖維軟骨細(xì)胞較合適。形態(tài)學(xué)上,半月板細(xì)胞在單層培養(yǎng)條件下顯示三種不同的細(xì)胞類(lèi)型:伸長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞、多邊形細(xì)胞和小圓的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞[10]。半月板組織ECM中膠原成分主要為I型膠原(占90%以上),此外,還含有II、III、V型等膠原成分[11]。有學(xué)者根據(jù)半月板細(xì)胞形態(tài)、分布和ECM的不同,把半月板細(xì)胞分為不同的細(xì)胞亞群:纖維軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和位于淺表層區(qū)的細(xì)胞。纖維軟骨細(xì)胞位于半月板內(nèi)側(cè)2/3和深部,呈圓形或橢圓形,有活躍的分泌功能,ECM成分主要為Ⅰ、Ⅱ型膠原,其比例為2:3,提供半月板的支架結(jié)構(gòu)和抗拉伸性能,還包括提供抗壓縮性能的蛋白多糖;成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞位于外周1/3,該區(qū)域含少量ECM,主要為Ⅰ型膠原[12]。再者,由于成年兔半月板組織細(xì)胞成分較少,我們采用1周齡新西蘭乳兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。II型膠原含量可能也與半月板組織的發(fā)育有關(guān)。綜上,本研究通過(guò)Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)鑒定第三代細(xì)胞仍具備半月板纖維軟骨細(xì)胞的表型。

    3.2 半月板細(xì)胞與支架材料的復(fù)合培養(yǎng)

    半月板細(xì)胞與支架材料的復(fù)合是體外構(gòu)建組織工程半月板的關(guān)鍵技術(shù),主要通過(guò)細(xì)胞和支架材料的雙向選擇評(píng)價(jià)其用于半月板組織工程的可行性。主要影響因素有:支架材料的組成、孔隙率、孔徑、厚度,細(xì)胞的種類(lèi)和代數(shù),植入方式、接種密度、時(shí)間,復(fù)合體所處的微環(huán)境等。Neves等[13]研究得出,細(xì)胞-支架復(fù)合物體外培養(yǎng)7天時(shí)能獲得最高的細(xì)胞密度。7天后細(xì)胞增殖到平臺(tái)期時(shí),ECM的合成速率顯著下降。故建議構(gòu)建組織工程半月板時(shí),細(xì)胞/支架復(fù)合物在體外培養(yǎng)不應(yīng)超過(guò)7天。Iwasa等[14]研究發(fā)現(xiàn),構(gòu)建軟骨組織工程接種的細(xì)胞密度應(yīng)不少于2×107/ml。本實(shí)驗(yàn)采用二次沉淀接種法將第三代半月板纖維軟骨細(xì)胞以2×107/ml種植于不同配比CS/CPP支架上,體外培養(yǎng)7天,該方法可以增加種子細(xì)胞沉積粘附的數(shù)量和ECM的分泌。

    3.3 生物材料的生物學(xué)界面反應(yīng)

    生物材料是構(gòu)建組織工程半月板的重要組成部分,也是影響組織構(gòu)建最關(guān)鍵的因素之一,用于組織修復(fù)再生的支架材料必須同時(shí)具有生物活性和生物可控降解性[15]。將細(xì)胞與三維多孔的支架材料聯(lián)合培養(yǎng)構(gòu)建組織是組織工程的基本方法[16,17]。人體細(xì)胞的微生態(tài)環(huán)境主要是它分泌的ECM和信號(hào)分子等有機(jī)生物活性物質(zhì)共同構(gòu)成細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境,調(diào)控細(xì)胞的正常代謝及遷移、增殖、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等活動(dòng)。研究細(xì)胞-生物材料的生物學(xué)界面(Biointerface)是深入探索構(gòu)建組織工程化半月板的本質(zhì)和基礎(chǔ),也是進(jìn)一步從仿生角度研發(fā)組織工程半月板支架材料的重要內(nèi)容。其生物學(xué)界面反應(yīng)是材料表面及降解產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化對(duì)細(xì)胞微生態(tài)環(huán)境的影響,從而導(dǎo)致細(xì)胞行為和分子水平功能蛋白基因表達(dá)的變化[18]。針對(duì)當(dāng)前生物材料和組織工程支架急需提高生物活性、可控降解性和促進(jìn)再生功能性等研究的熱點(diǎn)問(wèn)題,本課題研制了一種新型組織工程半月板支架——?dú)ぞ厶?聚磷酸鈣復(fù)合材料。殼聚糖結(jié)構(gòu)單元氨基葡萄糖與細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖類(lèi)似結(jié)構(gòu),能與生長(zhǎng)因子、受體和粘連蛋白產(chǎn)生許多特異相互作用,并可調(diào)控生物活性分子釋放,殼聚糖中大量自由氨基的存在使其表面具有很強(qiáng)的吸附作用,有利于細(xì)胞的粘附。通過(guò)對(duì)聚磷酸鈣制備工藝的研究,建立了計(jì)算聚合度的數(shù)學(xué)模型,其分子主鏈為“-P-O-P-”鍵,在結(jié)構(gòu)上仿生物活化能ATP的高能磷酸鍵[19];體外與半月板細(xì)胞的復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明,該鍵的斷裂為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了能量,明顯促進(jìn)半月板細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。因此,不同配比CS/CPP復(fù)合材料中,隨著CPP含量增加,半月板細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞外基質(zhì)呈逐漸增多的趨勢(shì);其中3:7的CS/CPP支架材料上半月板細(xì)胞數(shù)目最多,接近覆蓋整個(gè)支架表面,生長(zhǎng)極其旺盛,連接緊密,融合成片,細(xì)胞外基質(zhì)分泌也最多。再者,CPP降解過(guò)程中產(chǎn)生的鈣離子,可能參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用和信號(hào)分子的傳遞,細(xì)胞識(shí)別與粘合的分子機(jī)制主要通過(guò)細(xì)胞粘附因子介導(dǎo)細(xì)胞間或與細(xì)胞微生態(tài)環(huán)境間相互識(shí)別與結(jié)合,多數(shù)細(xì)胞粘附因子作用依賴鈣離子,存在鈣離子結(jié)合位點(diǎn),因此含CPP較多的復(fù)合材料更有利于半月板細(xì)胞的粘附,但目前CPP降解過(guò)程中產(chǎn)生的鈣離子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。

    綜上所述,我們探索使用一種天然材料海藻酸鈉來(lái)源研制的新型生物交聯(lián)劑ADA,采用化學(xué)交聯(lián)固化法,將CS、ADA和CPP有機(jī)結(jié)合起來(lái),制備一種新型多孔半月板組織工程支架材料,觀察半月板細(xì)胞在不同配比的CS/CPP支架材料上的生長(zhǎng)、增殖狀況,結(jié)果顯示:三維多孔的CS/CPP復(fù)合材料能促進(jìn)半月板細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng),其中3:7的CS/CPP支架材料細(xì)胞相容性和生物活性最好,最適于半月板纖維軟骨細(xì)胞粘附和生長(zhǎng),并能促進(jìn)半月板細(xì)胞增殖和維持其表型,有望成為組織工程半月板良好的支架載體。

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