半月板纖維軟骨細胞與殼聚糖/聚磷酸鈣體外復合培養(yǎng)的實驗研究

付維力 王踐云 李箭 萬昌秀 葉京兵 羅大輝 李棋

1 四川大學華西醫(yī)院骨科（成都 610041） 2 四川大學高分子科學與工程學院

近年來，利用組織工程原理和技術重建嚴重損傷的半月板或治療半月板缺失的患者，已成為國內(nèi)外研究的熱點[1-6]。目前，應用于組織工程半月板的支架材料還處于廣泛的篩選和試驗階段，而單一的無機材料和單一的有機材料均難以滿足臨床對組織工程半月板的生物活性及生物力學性能的綜合要求。如何結(jié)合天然和合成、有機和無機支架材料的各自優(yōu)點，構(gòu)建符合組織工程半月板要求的復合材料，是目前支架材料的研究熱點[7]。殼聚糖（chitosan，CS）具有良好的生物相容性和可調(diào)節(jié)的生物降解性能，其結(jié)構(gòu)單元氨基葡萄糖與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中蛋白多糖分子鏈的結(jié)構(gòu)單元糖胺聚糖相似。它屬于pH依賴性陽離子聚合物，可與陰離子反應生成聚電解質(zhì)配合物而具多重生物活性，其單體上的氨基基團可作為活性基團與醛基反應。但其缺點是力學強度不夠。而聚磷酸鈣（calcium polyphosphate，CPP）具有良好的生物相容性和良好的化學穩(wěn)定性，并具備優(yōu)良的力學性能。殼聚糖與聚磷酸鈣兩者復合可以取長補短，提高其力學強度和生物相容性。因傳統(tǒng)交聯(lián)劑如戊二醛、乙二胺等隨著材料降解逐漸出現(xiàn)毒副作用，本實驗針對復合支架材料的降解和交聯(lián)劑的選擇等問題，探索了一種天然材料海藻酸鈉來源研制的新型生物交聯(lián)劑醛基化海藻酸鈉（aldehyde alginate，ADA）[8，9]，在此基礎上，采用化學交聯(lián)固化法將CS、ADA和CPP有機地結(jié)合起來，制備一種新型多孔半月板組織工程支架材料；通過觀察半月板細胞在不同配比CS/CPP支架材料上的生長、增殖狀況，為支架材料探索最佳的CS/CPP比例，為組織工程半月板支架材料的優(yōu)選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

實驗動物:清潔級健康1周齡新西蘭乳兔，雌雄不限，約200～300 g，由四川大學華西動物實驗中心提供。1:1 DMEM/F12（DF）、FBS、胰蛋白酶、EDTA、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱（SANYO公司，日本）；離心機（Eppendorf公司，德國），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），掃描電鏡（JSM-6700F，JEOL，日本）；鼠抗兔Ⅰ型膠原單克隆抗體、鼠抗兔Ⅱ型膠原單克隆抗體（Oncogene公司，美國）；SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；碳酸鈣、磷酸、高碘酸鈉（分析純，成都科龍化工試劑廠）；海藻酸鈉（分析純，浙江晶巖生物有限公司）；殼聚糖（醫(yī)用級，浙江澳興生物有限公司）。

1.2 半月板纖維軟骨細胞的分離培養(yǎng)

無菌條件下取1周齡新西蘭乳兔雙膝內(nèi)外側(cè)半月板，放入盛有DF培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用含1%慶大霉素的PBS沖洗3遍，剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎塊，然后用0.25%胰蛋白酶37℃預消化30 min，再加入0.2%Ⅱ型膠原酶37℃恒溫水浴搖床振蕩消化4～6 h。經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細胞消化下來后，用巴氏吸管吹打2 min，終止消化，用200目篩網(wǎng)過濾消化后的細胞懸液，1.2k r/min離心5 min，棄上清，PBS洗兩次，細胞按1×106/瓶重懸于含10%FBS的DF培養(yǎng)基的底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換液1次，隔日倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化和生長情況。待細胞鋪滿瓶底（80%～90%融合）后，用含0.1%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化傳代。通過細胞化學（HE染色、甲苯胺藍、番紅O）、Ⅰ型和Ⅱ型膠原免疫組化對體外培養(yǎng)的半月板細胞進行表型鑒定，取第3代細胞進行實驗。

1.3 殼聚糖/聚磷酸鈣復合支架材料的制備

稱取質(zhì)量比例分別為10:0、7:3、5:5、3:7的CS、CPP，分別溶入醋酸溶液和無水乙醇，共混加熱攪拌制備成均一的CS/CPP混合物，加入ADA溶液交聯(lián)，高速攪拌2 min。迅速將制備的CPP/CS/ADA凝膠轉(zhuǎn)入到模具中，將填有凝膠混合物的模具轉(zhuǎn)入冰箱中，于-20℃冷凍4 h，使固液相分離。之后使用冷凍干燥機于壓力為0.5 mmHg、-5℃條件下干燥24 h，以完全除去溶劑。干燥完畢后，即得到不同CS/CPP比例的復合多孔支架。取制備的不同配比CS/CPP三維多孔支架，樣品表面噴鉑金處理后，于掃描電鏡下觀察樣品的結(jié)構(gòu)形貌，通過排液法測定支架的孔隙率。取三維多孔支架（直徑5 mm，高3 mm）分別加入6孔板內(nèi)，封口后經(jīng)Co-60 射線（照射總劑量為25KGy）消毒后備用。

1.4 組織工程化半月板的體外復合培養(yǎng)

取單層培養(yǎng)條件下生長良好的第三代半月板纖維軟骨細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA按1:1混合酶消化，收集細胞，制備2×107/ml密度的細胞懸液。用10 μl的微量移液槍將細胞懸液以10 μl/材料樣品緩慢均勻滴加于材料上，然后放于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，使細胞粘附到材料中。再將剩下的細胞滴加到材料上，并于材料底部滴加10μl培養(yǎng)基保濕，置于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，使接種的半月板細胞第二次沉淀到支架上，緩慢從材料旁邊加入含10%FBS的DF培養(yǎng)液進行復合培養(yǎng)。隔日換液，體外復合培養(yǎng)7 d。

1.5 觀察指標

形態(tài)學觀察:復合后，隔日于倒置相差顯微鏡下觀察細胞在支架材料上的生長和粘附情況。

組織學染色觀察:復合培養(yǎng)7 d后，各取一塊不同配比的材料于4%多聚甲醛中固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片，行HE組織化學染色，光鏡下觀察。

掃描電鏡觀察:復合培養(yǎng)7 d后取出標本，分別取一塊不同配比的材料PBS漂洗，2.5%戊二醛固定2 h，PBS沖洗，梯度乙醇上行脫水，醋酸異戊酯保存，CO2干燥器干燥、噴金、黏托，掃描電鏡觀察細胞在材料上的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 半月板纖維軟骨細胞的分離培養(yǎng)觀察（圖1）

半月板纖維軟骨細胞原代接種后8 h有少量細胞開始貼壁，48～72 h多數(shù)細胞貼壁完全，胞質(zhì)逐漸展開，細胞變大伸長，形成突起，呈多角形，細胞形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，鏡下觀察有立體感，出現(xiàn)明顯的集落樣分區(qū)，表現(xiàn)“細胞群聚”現(xiàn)象，7～9 d后，細胞長滿傳代。傳代后細胞貼壁生長能力和增殖速度明顯加快。第2代后細胞形態(tài)開始逐漸變?yōu)樗笮危?代后細胞生長速度減慢，增殖減緩。細胞HE染色、甲苯胺藍、番紅O和免疫組化染色顯示:體外分離培養(yǎng)的第3代半月板細胞Ⅰ型和Ⅱ型膠原均表達陽性，并分泌蛋白聚糖，其基本維持半月板纖維軟骨細胞的表型。

2.2 支架材料的檢測

掃描電鏡下觀察可見:孔徑大小和分布較均勻，并且相互貫通，孔徑分布在200～500 μm之間（圖2）。通過排液法測定支架的孔隙率在75%～86%之間。使用ADA交聯(lián)制備出的復合支架生物材料具有較高的孔隙率和孔徑。

2.3 半月板纖維軟骨細胞與殼聚糖/聚磷酸鈣體外復合培養(yǎng)觀察

2.3.1 倒置相差顯微鏡觀察

半月板纖維軟骨細胞接種后呈球形，黏附于多孔支架邊緣，培養(yǎng)液中可見少量懸浮細胞，1 h后細胞開始貼壁，4 h后大部分細胞貼壁完全，呈短梭形或多角形，形態(tài)規(guī)則；3～5 d后可見細胞在支架上黏附良好，支架孔隙逐漸被細胞以及分泌的基質(zhì)填滿，細胞支架復合體輪廓逐漸明顯。

2.3.2 HE染色

HE染色（圖3）可見:半月板軟骨細胞粘附于支架材料上，呈梭形或多角形，胞漿紅染，細胞核呈圓形或者卵圓形?？梢姾巳屎图毎|(zhì)，細胞可見分裂相?？锥磧?nèi)可見細胞生長，并有基質(zhì)分泌。

2.3.3 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察（圖4）可見，復合培養(yǎng)7 d，細胞在支架上均勻分布，緊貼支架上生長，細胞多數(shù)呈多角形，形態(tài)規(guī)則，大小均一，立體感強，可見大量基質(zhì)分泌。其中3:7的CS/CPP支架材料上，半月板細胞生長良好，數(shù)目最多，接近覆蓋整個支架表面，生長極其旺盛，連接緊密，融合成片，細胞外基質(zhì)分泌也最多。

3 討論

3.1 半月板纖維軟骨細胞的鑒定

圖1 MFCs形態(tài)學、細胞化學和免疫組化染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）

圖2 掃描電鏡觀察不同比例CS/CPP復合三維多孔支架（×1200）

圖3 MFCs與不同比例CS/CPP復合培養(yǎng)7d組織學觀察（HE×200）

圖4 MFCs與不同比例CS/CPP復合培養(yǎng)7d掃描電鏡觀察（×1200）

對于將半月板細胞歸類于軟骨細胞還是成纖維細胞，一直存在爭議。有學者研究發(fā)現(xiàn)，半月板組織包含成纖維細胞樣細胞和軟骨細胞兩種細胞亞型，因此認為將其稱為纖維軟骨細胞較合適。形態(tài)學上，半月板細胞在單層培養(yǎng)條件下顯示三種不同的細胞類型:伸長的成纖維細胞樣細胞、多邊形細胞和小圓的軟骨細胞樣細胞[10]。半月板組織ECM中膠原成分主要為I型膠原（占90%以上），此外，還含有II、III、V型等膠原成分[11]。有學者根據(jù)半月板細胞形態(tài)、分布和ECM的不同，把半月板細胞分為不同的細胞亞群:纖維軟骨細胞、成纖維細胞樣細胞和位于淺表層區(qū)的細胞。纖維軟骨細胞位于半月板內(nèi)側(cè)2/3和深部，呈圓形或橢圓形，有活躍的分泌功能，ECM成分主要為Ⅰ、Ⅱ型膠原，其比例為2:3，提供半月板的支架結(jié)構(gòu)和抗拉伸性能，還包括提供抗壓縮性能的蛋白多糖；成纖維細胞樣細胞位于外周1/3，該區(qū)域含少量ECM，主要為Ⅰ型膠原[12]。再者，由于成年兔半月板組織細胞成分較少，我們采用1周齡新西蘭乳兔為實驗動物。II型膠原含量可能也與半月板組織的發(fā)育有關。綜上，本研究通過Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達鑒定第三代細胞仍具備半月板纖維軟骨細胞的表型。

3.2 半月板細胞與支架材料的復合培養(yǎng)

半月板細胞與支架材料的復合是體外構(gòu)建組織工程半月板的關鍵技術，主要通過細胞和支架材料的雙向選擇評價其用于半月板組織工程的可行性。主要影響因素有:支架材料的組成、孔隙率、孔徑、厚度，細胞的種類和代數(shù)，植入方式、接種密度、時間，復合體所處的微環(huán)境等。Neves等[13]研究得出，細胞－支架復合物體外培養(yǎng)7天時能獲得最高的細胞密度。7天后細胞增殖到平臺期時，ECM的合成速率顯著下降。故建議構(gòu)建組織工程半月板時，細胞/支架復合物在體外培養(yǎng)不應超過7天。Iwasa等[14]研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建軟骨組織工程接種的細胞密度應不少于2×107/ml。本實驗采用二次沉淀接種法將第三代半月板纖維軟骨細胞以2×107/ml種植于不同配比CS/CPP支架上，體外培養(yǎng)7天，該方法可以增加種子細胞沉積粘附的數(shù)量和ECM的分泌。

3.3 生物材料的生物學界面反應

生物材料是構(gòu)建組織工程半月板的重要組成部分，也是影響組織構(gòu)建最關鍵的因素之一，用于組織修復再生的支架材料必須同時具有生物活性和生物可控降解性[15]。將細胞與三維多孔的支架材料聯(lián)合培養(yǎng)構(gòu)建組織是組織工程的基本方法[16，17]。人體細胞的微生態(tài)環(huán)境主要是它分泌的ECM和信號分子等有機生物活性物質(zhì)共同構(gòu)成細胞生長的環(huán)境，調(diào)控細胞的正常代謝及遷移、增殖、分化、信號轉(zhuǎn)導等活動。研究細胞－生物材料的生物學界面（Biointerface）是深入探索構(gòu)建組織工程化半月板的本質(zhì)和基礎，也是進一步從仿生角度研發(fā)組織工程半月板支架材料的重要內(nèi)容。其生物學界面反應是材料表面及降解產(chǎn)物的動態(tài)變化對細胞微生態(tài)環(huán)境的影響，從而導致細胞行為和分子水平功能蛋白基因表達的變化[18]。針對當前生物材料和組織工程支架急需提高生物活性、可控降解性和促進再生功能性等研究的熱點問題，本課題研制了一種新型組織工程半月板支架——殼聚糖/聚磷酸鈣復合材料。殼聚糖結(jié)構(gòu)單元氨基葡萄糖與細胞外基質(zhì)中糖胺聚糖類似結(jié)構(gòu)，能與生長因子、受體和粘連蛋白產(chǎn)生許多特異相互作用，并可調(diào)控生物活性分子釋放，殼聚糖中大量自由氨基的存在使其表面具有很強的吸附作用，有利于細胞的粘附。通過對聚磷酸鈣制備工藝的研究，建立了計算聚合度的數(shù)學模型，其分子主鏈為“-P-O-P-”鍵，在結(jié)構(gòu)上仿生物活化能ATP的高能磷酸鍵[19]；體外與半月板細胞的復合培養(yǎng)實驗表明，該鍵的斷裂為細胞生長提供了能量，明顯促進半月板細胞的粘附和生長。因此，不同配比CS/CPP復合材料中，隨著CPP含量增加，半月板細胞數(shù)量和細胞外基質(zhì)呈逐漸增多的趨勢；其中3:7的CS/CPP支架材料上半月板細胞數(shù)目最多，接近覆蓋整個支架表面，生長極其旺盛，連接緊密，融合成片，細胞外基質(zhì)分泌也最多。再者，CPP降解過程中產(chǎn)生的鈣離子，可能參與細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用和信號分子的傳遞，細胞識別與粘合的分子機制主要通過細胞粘附因子介導細胞間或與細胞微生態(tài)環(huán)境間相互識別與結(jié)合，多數(shù)細胞粘附因子作用依賴鈣離子，存在鈣離子結(jié)合位點，因此含CPP較多的復合材料更有利于半月板細胞的粘附，但目前CPP降解過程中產(chǎn)生的鈣離子參與信號轉(zhuǎn)導的分子生物學機制仍不清楚。

綜上所述，我們探索使用一種天然材料海藻酸鈉來源研制的新型生物交聯(lián)劑ADA，采用化學交聯(lián)固化法，將CS、ADA和CPP有機結(jié)合起來，制備一種新型多孔半月板組織工程支架材料，觀察半月板細胞在不同配比的CS/CPP支架材料上的生長、增殖狀況，結(jié)果顯示:三維多孔的CS/CPP復合材料能促進半月板細胞的粘附、生長，其中3:7的CS/CPP支架材料細胞相容性和生物活性最好，最適于半月板纖維軟骨細胞粘附和生長，并能促進半月板細胞增殖和維持其表型，有望成為組織工程半月板良好的支架載體。

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