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    興奮劑生長激素檢測方法研究進(jìn)展

    2012-11-17 11:21:50周鑫淼謝敏豪
    關(guān)鍵詞:興奮劑生長激素檢測法

    周鑫淼 謝敏豪

    1 北京體育大學(xué)(北京 100084) 2 國家體育總局反興奮劑中心

    人生長激素是人體自身分泌的重要的肽類激素。重組人生長激素不僅應(yīng)用于臨床醫(yī)療,也被濫用于體育運(yùn)動中,以提高運(yùn)動成績。生長激素的檢測方法一直是世界各國反興奮劑工作的研究熱點(diǎn)。

    1 生長激素概況

    人生長激素(hGH)是由腦垂體基底前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的肽類激素,在人體內(nèi)發(fā)揮著重要而多樣的生物學(xué)作用[1]。其主要作用為促進(jìn)人體生長,也參與蛋白質(zhì)、脂類及碳水化合物的代謝。其分泌方式呈脈沖式,分泌呈明顯的晝夜節(jié)律性變化,主要受生長激素釋放激素[2]或生長抑素[3]等激素的調(diào)控。

    隨著蛋白重組技術(shù)的發(fā)展[4],重組人生長激素(rhGH)取代了從尸體腦垂體分離hGH的方式,逐漸被應(yīng)用于臨床治療。目前,rhGH主要被用于治療幼兒及成人的生長激素缺乏癥,同時也被應(yīng)用于幼兒特納氏綜合征的治療、慢阻肺以及燒傷等嚴(yán)重創(chuàng)傷的治療中。近些年來,由于hGH具有蛋白同化、調(diào)節(jié)體成分的作用,rhGH已經(jīng)開始扮演“非治療用藥”的角色,用于抗衰老[1]。

    2 hGH的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及其亞型

    2.1 hGH基因簇

    hGH是由腦垂體分泌的最重要肽類激素,其基因簇位于人第17對染色體長臂,長46.83kb,包含5個與hGH相關(guān)的基因[5],分別為GH-N,GH-V,CS-A,CS-B和CS-L。其中GH-N和GH-V為編碼hGH的基因;CS-A和CS-B編碼絨毛膜生長催乳素,CS-L表達(dá)量很低,沒有有效翻譯?;虼刂?個基因都是由5個外顯子和4個內(nèi)含子構(gòu)成的。GH-N在垂體表達(dá),產(chǎn)生人體內(nèi)正常的hGH;GH-V、CS-A、CS-B在胎盤中表達(dá),并且隨著孕期的增加表達(dá)量持續(xù)升高[6]。

    2.2 hGH的亞型

    2.2.1 22kD-hGH

    hGH在人體內(nèi)有很多種類,其中最主要的,也是含量最高的是22kD-hGH,它是由GH-N轉(zhuǎn)錄后去掉26個氨基酸的信號肽得到的191個氨基酸的肽類激素,約占垂體hGH的70%~75%,占血液循環(huán)hGH的43%[6];是一條單鏈非糖化的親水性球蛋白,相對分子量為22124d;包含了四個半胱氨酸(cys)殘基,這四個cys殘基在分子內(nèi)分別形成兩對二硫鍵(cys53-cys165,cys182-cys189),使分子具有一大一小兩個環(huán)。22 kD hGH的三級結(jié)構(gòu)包含4個反向平行的 螺旋,螺旋之間由易于延伸的片段連接[7,8]。

    22kD-hGH作為hGH主要亞型,與受體結(jié)合,起促人體生長、合成及脂肪代謝的作用。

    2.2.2 20kD-hGH

    hGH在人體內(nèi)含量排在第二位的是20kD-hGH,它是由GH-N轉(zhuǎn)錄后mRNA選擇性剪接得到的,亦由人垂體分泌,其含量較22kD-hGH少,占血液循環(huán)中hGH的5%~10%。這種含有176個氨基酸殘基的單一肽鏈容易形成二聚體,包括同型二聚體和與22kD-hGH形成的異型二聚體。20kD-hGH較22kD-hGH少了N端第32~46位的15個氨基酸殘基,但是它仍然保持了原有的兩對二硫鍵,這樣使得20kD-hGH可以正常折疊并具有和22kD-hGH相似的分子結(jié)構(gòu)以及功能。但是由于與22kD-hGH相比,缺少了第1螺旋的C端以及第1螺旋與第2螺旋之間的環(huán)狀結(jié)構(gòu),因此影響20kD-hGH與受體的結(jié)合能力[6]。

    Hayakawa 等指出,20kD-hGH的促合成作用和22kD-hGH相當(dāng)[9];此外,20kD-hGH具有促進(jìn)脂肪降解、促進(jìn)IGF-I生成以及調(diào)節(jié)免疫等功能。

    2.2.3 5kD-hGH和17kD-hGH

    相對分子量為5 kD和17 kD的hGH是由22 kD-hGH經(jīng)蛋白酶切割后得到的兩個片斷。5kD-hGH是22kD-hGH的氨基末端多肽,由N端1~43個氨基酸殘基組成;17kD-hGH則由第44~191位共148個氨基酸殘基組成。通過各種免疫方法檢測證實(shí),二者在人垂體和血液中均有分布。

    對嚙齒類動物及狗進(jìn)行的試驗(yàn)顯示,5kD和17kD hGH具有調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝平衡的生理功能,在肥胖型小鼠模型或者垂體切除的小鼠中可以檢測到5 kD hGH有類似胰島素樣活性[10];而17 kD hGH則可致肥胖黃鼠糖耐量異常,兩者均無促進(jìn)生長作用。

    目前關(guān)于17kD的表述,說法不一。有的研究人員認(rèn)為,17kD-hGH在血液循環(huán)中有很高的濃度[11,12],并且通過水解實(shí)驗(yàn)證明了體內(nèi)17kD的存在;同時,也有研究人員認(rèn)為,體內(nèi)并不存在17kD-hGH,而是由于蛋白酶水解22kD-hGH而產(chǎn)生的片段而已。

    3 生長激素濫用情況及檢測方法現(xiàn)狀

    3.1 生長激素的濫用情況

    由于hGH具有促進(jìn)蛋白合成作用,此外在預(yù)防和恢復(fù)骨折中也有潛在的作用,自20世紀(jì)80年代至今,rhGH一直被懷疑用于體育運(yùn)動的不正當(dāng)競爭。國際奧委會(IOC)于1992年將其列入禁用清單[13],世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(WADA)也在1999年將其列入禁用清單[14]。

    2010年2月,英國反興奮劑機(jī)構(gòu)查出了世界上第1例違規(guī)使用rhGH的檢測陽性,使用者是一名橄欖球運(yùn)動員[15],截止2011年9月,世界上共有3例生長激素檢測陽性,其中含用藥豁免1例[16]。2000年以來,多次報道與運(yùn)動員攜帶生長激素等有關(guān)的案例。例如:在2000年悉尼奧運(yùn)會期間,一名田徑教練曾試圖攜帶rhGH進(jìn)入澳大利亞[5];在2002年環(huán)法自行車比賽結(jié)束后,曾在季軍運(yùn)動員妻子的汽車中發(fā)現(xiàn)rhGH[5];在2004年12月越野滑雪世界杯的比賽中,一名運(yùn)動員在完成興奮劑檢查后將腰包遺落在了興奮劑檢查站,后被發(fā)現(xiàn)其腰包內(nèi)裝有rhGH,國際滑雪聯(lián)合會(FIS)于2005年2月19日決定對相關(guān)運(yùn)動員處以2年禁賽的處罰[17]。

    3.2 興奮劑生長激素的檢測

    目前,rhGH的檢測方法仍是世界反興奮劑工作的一大難題。內(nèi)源性22kDhGH與外源性hGH氨基酸序列以及結(jié)構(gòu)缺乏差異性,同時hGH的分泌呈脈沖式,與年齡、運(yùn)動、性別、睡眠、飲食均有關(guān)且代謝速率快,導(dǎo)致無法將臨床直接測定hGH濃度的方法用于鑒別興奮劑生長激素。目前,研究較為透徹、完整的rhGH興奮劑檢測方法分為兩大類,分別為rhGH直接檢測法和rhGH間接檢測法[5]。

    3.2.1 rhGH直接檢測法

    垂體分泌的內(nèi)源性hGH包括了多種亞型,而商業(yè)生產(chǎn)的rhGH僅有22kD-hGH一種形式。雖然人體內(nèi)由于年齡、性別、睡眠、飲食、運(yùn)動等多種因素,hGH濃度相差較大,但是各種hGH亞型之間的比例是恒定的。外源性使用rhGH后,由于內(nèi)分泌系統(tǒng)的負(fù)反饋抑制作用,會迅速抑制人體內(nèi)源性hGH的分泌,從而導(dǎo)致22kD-hGH與非22kD-hGH比例大幅升高。因此,22kD-hGH亞型與非22kD-hGH的比值可作為rhGH使用的檢測依據(jù)。

    研究人員利用免疫學(xué)技術(shù),分別得到了22kD-hGH的單克隆抗體以及非22kD-hGH的單克隆抗體[18]。通過ELISA技術(shù),利用單克隆抗體即可分別測定22kD-hGH的濃度和非22kD-hGH的濃度,然后計算比值。在研究中,rhGH使用組的數(shù)據(jù)與未使用組的數(shù)據(jù)很好地區(qū)分開,并且在兩種之間沒有交叉重疊出現(xiàn)[19]。

    在原有的相同抗體的基礎(chǔ)上,96孔時間分辨熒光免疫測定試劑盒(TRFIA)在2004年雅典奧運(yùn)會以及2006年都靈冬奧會的興奮劑檢測中進(jìn)行了評估。世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(WADA)制定的《世界反興奮劑條例》及《實(shí)驗(yàn)室國際標(biāo)準(zhǔn)》中要求,確證任何的陽性結(jié)果均需要一個獨(dú)立的試驗(yàn)。對于免疫學(xué)試驗(yàn)來說,“獨(dú)立的試驗(yàn)”意味著要有獨(dú)立的表面抗原決定簇的抗體。為此,在原有抗體的基礎(chǔ)上,又得到了另外一對與原抗體識別位點(diǎn)不同的單克隆抗體,從而形成了對rhGH及垂體分泌hGH(phGH)擁有不同識別位點(diǎn)的兩對ELISA化學(xué)發(fā)光試劑盒recA與pitA以及recB與pitB,利用發(fā)光免疫分析技術(shù)(ILMA)進(jìn)行檢測。這些以包被管為載體的試劑盒通過一些WADA認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)室比對和方法驗(yàn)證,得到了WADA的認(rèn)可。目前,該試劑盒被德國柏林的一家公司生產(chǎn),命名為“GNZ-Zssay GmbH”,作為WADA公認(rèn)的rhGH檢測試劑盒,并已在2008年北京奧運(yùn)會、2010年溫哥華冬奧會等重大賽事中及目前的rhGH的賽外檢查中使用[5]。

    3.2.2 rhGH間接檢測法

    rhGH直接檢測法檢測窗口期較短,因此,研究對rhGH產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)(產(chǎn)物)的檢測方法——間接檢測法,具有重要的實(shí)用價值。間接檢測法與直接檢測法相比,增加了rhGH使用后可檢出時間。rhGH注射后會導(dǎo)致血液中多種生物指標(biāo)發(fā)生變化,這些指標(biāo)比hGH更加穩(wěn)定,在人體內(nèi)也有更長的半衰期[19],同時也不會因?yàn)檫\(yùn)動、禁食等狀態(tài)顯著變化[1]。間接檢測法就是在此基礎(chǔ)上建立的,通過檢測體內(nèi)其他與hGH相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)判定rhGH使用的檢測方法。

    hGH發(fā)揮其蛋白同化等生理作用主要是由IGF-Ⅰ介導(dǎo)完成的。IGF-Ⅰ在血液中與IGF結(jié)合蛋白(IGFBPs)結(jié)合,完成轉(zhuǎn)運(yùn)。hGH分泌同時還會影響膠原蛋白及骨代謝,這些作用主要通過從骨組織及軟組織中釋放入血的蛋白質(zhì)中反映出來,例如P-Ⅲ-P等。這些由hGH變化受到影響的蛋白中,有的非常穩(wěn)定,經(jīng)常維持在基本值上,同時在運(yùn)動期間也表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。但同時,這些物質(zhì)的代謝物在尿中含量過低或不穩(wěn)定,不能用于興奮劑檢測。

    為了研究rhGH的檢測方法,WADA建立了GH2000計劃,通過評估血清中不同的生物學(xué)指標(biāo)來檢測rhGH的濫用。選取了對使用rhGH敏感但對運(yùn)動不敏感,且較穩(wěn)定的生物學(xué)指標(biāo):IGF-Ⅰ和P-Ⅲ-P,并建立了rhGH使用的判定公式:

    男性指標(biāo) = –6.586+2.905×ln(P-Ⅲ -P)+2.100× ln (IGF1)–101.737/age

    女性指標(biāo) = –8.459+2.454×ln(P-Ⅲ -P)+2.195× ln (IGF1)–73.666/age

    由于GH2000項目中的受試者均為高加索人種,為了驗(yàn)證其在其他人種間的平行性,WADA建立了GH2004計劃,評估印度、中東、非洲及中國人群的數(shù)據(jù)。試驗(yàn)證明,上述公式在其他人群中與高加索人基本一致。但是在GH2004項目中,發(fā)現(xiàn)P-Ⅲ-P指標(biāo)與傷病有一定的相關(guān)性,受傷后P-Ⅲ-P濃度會增加20%,并維持2~3周[25]。

    其他研究表明,健康男性急性注射rhGH后,IGF-Ⅰ和IGFBP-3濃度會持續(xù)升高至少1天,同時IGFBP-2濃度下降,IGF-Ⅰ/IGFBP-2與IGF-Ⅰ/IGFBP-3的比例可以考慮發(fā)展作為運(yùn)動員rhGH使用的檢測指標(biāo)。

    4 直接檢測法的進(jìn)一步優(yōu)化

    目前,直接檢測法作為WADA公認(rèn)的rhGH檢測方法已開始使用,但是從檢測結(jié)果來看,目前世界上僅有3例生長激素實(shí)驗(yàn)室檢測陽性,其中包含1例申報治療用藥豁免(TUE)。

    直接檢測法雖然能夠明確地鑒別出使用rhGH的樣本,但是由于22kD/非22kD比值在注射rhGH后不久就能恢復(fù)正常,窗口期非常短,很難對運(yùn)動員實(shí)施有效監(jiān)控。此外,非22kD-hGH種類繁多,針對所有非22kD-hGH產(chǎn)生的單克隆抗體,其穩(wěn)定性、特異性以及干擾因素都很難準(zhǔn)確評估。間接檢測法與直接檢測法相比,雖然具有較長的窗口期,能夠檢測相關(guān)指標(biāo)在停藥后較長時間的異常變化,但是間接指標(biāo)仍有待于世界反興奮劑機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。顯然,直接檢測方法的有效性仍有待提高。

    目前,針對直接檢測法的研究仍在繼續(xù)和深入,內(nèi)容涉及建立基礎(chǔ)方法、優(yōu)化下游實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及優(yōu)化判定依據(jù)三方面。

    4.1 直接檢測法的基礎(chǔ)研究

    目前直接檢測法的檢測依據(jù)是檢測22kD-hGH與非22kD-hGH的比值,而非22kD-hGH包括多種不同亞型的hGH。因此其單克隆抗體的穩(wěn)定性、特異性以及干擾因素都很復(fù)雜,不如單一蛋白質(zhì)所得到的單抗穩(wěn)定。目前直接檢測法的研究主要是建立以非22kD-hGH中單一亞基為檢測指標(biāo)的檢測方法。

    針對目前的試劑盒,WADA資助各國實(shí)驗(yàn)室開展關(guān)于20k-DhGH單克隆抗體的研究,試圖考慮將22kD與20kD-hGH濃度的比例作為興奮劑檢測的指標(biāo)。Wallace等對17名年齡(26.9±1.5)歲、具備有氧訓(xùn)練史的健康男性,進(jìn)行了隨機(jī)重復(fù)的靜止抗阻力訓(xùn)練。訓(xùn)練構(gòu)成為20分鐘不間斷蹬功率自行車,達(dá)到80%最大攝氧量。研究結(jié)果顯示,體內(nèi)hGH所有亞型的濃度均上升,運(yùn)動結(jié)束后達(dá)到峰值,在運(yùn)動過程中,22kD始終是體內(nèi)hGH的主要形式;運(yùn)動后非22kD亞型的比例升高,這可能與20kD清除較慢或其他非22kD亞型導(dǎo)致。不同亞型hGH的多樣的生物學(xué)作用是否會影響運(yùn)動后的hGH動態(tài)平衡,仍然是一個有待討論的問題[20]。另有研究表明,正常生理狀態(tài)下以及其他藥物作用下,22kD與20kD hGH亞型的比例是恒定不變的,其比例變化與外源性rhGH的使用高度相關(guān)[21]。20kD的比例不受年齡、性別、青春期、體重指數(shù)(BMI)以及hGH分泌量的影響,相對固定,相同的結(jié)論在其他研究人員的研究中也有報道[20]。由此得出,可以將20kD與22kD的比值作為判定外源性使用rhGH的有效指標(biāo)。

    目前,中國反興奮劑中心檢測實(shí)驗(yàn)室等5個實(shí)驗(yàn)室都分別得到了20kD-hGH的單克隆抗體。其中我國實(shí)驗(yàn)室與日本實(shí)驗(yàn)室Toshio Tsushima得到的單克隆抗體穩(wěn)定性好,且與其他亞型hGH的交叉性較低[22]。但目前,各實(shí)驗(yàn)室均未制成能提供市售的20kD-hGH檢測試劑盒。

    4.2 優(yōu)化下游實(shí)驗(yàn)技術(shù)的研究

    為了使目前的rhGH檢測方法以及正在研究中的20kD-hGH/22kD-hGH的檢測方法更有效地檢測rhGH的濫用情況,檢測技術(shù)的優(yōu)化也是檢測方法研究的重要部分,其主要目的是建立穩(wěn)定的材料及數(shù)據(jù)來源,并提高實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、可重復(fù)性及靈敏性。為了達(dá)到這個目的,目前的優(yōu)化方式主要包括:1、將檢測抗體更換為純化的山羊體內(nèi)分泌的抗人GH抗體;2、利用生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)(biotin-avidin complex)調(diào)整檢測條件,從而達(dá)到放大信號的作用[23]。

    此外,針對hGH直接檢測法,目前還有一項正在開展的研究,即以ELISA為工作原理,利用流式細(xì)胞技術(shù)開展hGH亞型濃度的測定。該技術(shù)將抗體固化在聚苯乙烯微光束上并用特定的熒光標(biāo)記,最后通過流式細(xì)胞儀分別篩選不同類別的亞型并測定濃度。該方法將大幅提高檢測靈敏度,將檢測級別提高至 pg/ml[23]。

    4.3 優(yōu)化判定依據(jù)的研究

    關(guān)于rhGH直接檢測法的檢測陽性判定依據(jù),WADA也在根據(jù)數(shù)據(jù)的積累逐步調(diào)整。2010年,“rhGH檢測方法指南”發(fā)布前,男子與女子的判定限差別較大,女子的判定限低于男子,具體判定限見表1。2010年6月,“rhGH檢測方法指南”發(fā)布后,根據(jù)近幾年的數(shù)據(jù),對原有的判定限進(jìn)行了調(diào)整。提高了kit1的判定限,降低了kit2的判定限,同時男女之間的差別縮小。

    關(guān)于判定依據(jù)的研究,我國興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室針對中國人群挑選了25名年輕男性開展了rhGH受試研究,受試劑量為0.1IU/kg/d。依據(jù)目前的判定限,單次注射rhGH后,檢測窗口平均在12至18小時之間,最長的為21小時,最短的檢測窗口僅為6小時,低于Bidlingmaier等得出的32小時[18]。根據(jù)WADA實(shí)驗(yàn)室技術(shù)文件TD2010DL,我國興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室依據(jù)自2008年以來近3年的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),推算出了更適于中國人群的判定限應(yīng)在1.5左右。與受試項目的檢測數(shù)據(jù)比對,該數(shù)據(jù)能夠延長檢測窗口[24]。

    表1 rhGH判定依據(jù)比對

    5 展望

    作為目前WADA唯一認(rèn)可使用的rhGH檢測方法,雖然hGH直接檢測法的窗口期很短,但是作為事先無通知的賽外檢查,直接檢測法仍然是一種有效的rhGH濫用的檢測方法,其穩(wěn)定性高,不會受到運(yùn)動、年齡、飲食等身體狀態(tài)的影響。22kD-hGH與20kD-hGH的比例測定將因其亞型的單一性及穩(wěn)定性,成為直接檢測法的發(fā)展趨勢。

    同時,在發(fā)展直接檢測法的同時,針對檢測窗口短的缺陷,生長激素檢測方法的研究還應(yīng)致力于穩(wěn)定性高且檢測窗口長的檢測方法。例如:間接指標(biāo)檢測法、白細(xì)胞基因表達(dá)等。

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