乙草胺、丁草胺及其復合污染對浮萍的毒性效應研究

梁衛(wèi)玲，唐美珍，王艷娜

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜273165）

1 引言

浮萍（Lemna s p p）為漂浮水生維管束植物，全球分布廣泛，是一種有效的環(huán)境監(jiān)測植物［1～7］，常被用于植物生理學研究。近年來，國外諸多學者已經(jīng)對浮萍在水生生態(tài)毒理學方面的應用進行了深入的探究［1～4］，浮萍的保存方法以及與其相關(guān)的實驗方法也已報道，而在國內(nèi)，以浮萍作為毒理學材料的研究和應用并不多。目前，國內(nèi)外關(guān)于農(nóng)藥對藻類的毒性效應研究已經(jīng)比較全面，但一般為研究單一毒物對浮萍的生長抑制試驗［7～9］，關(guān)于農(nóng)藥的復合污染對浮萍生長抑制實驗的研究尚少。

POD是植物體內(nèi)重要的氧化還原酶，可催化有毒物質(zhì)如活性氧等的氧化分解，是反映污染脅迫的靈敏指標。當農(nóng)藥進入植物組織后，產(chǎn)生的有毒物質(zhì)在POD酶正常分解能力范圍內(nèi)時，POD活性會隨酶底物濃度的增加而提高；當POD活性降低時表明有毒物質(zhì)濃度已超出其正常分解能力，使活性氧自由基濃度上升，對植物產(chǎn)生傷害。

本實驗以我國廣泛使用的除草劑乙草胺及丁草胺為供試農(nóng)藥，以浮萍為研究對象，以POD活性為測定指標，探究了乙草胺和丁草胺單獨作用與復合作用對浮萍POD活性的影響，為利用浮萍監(jiān)測水體污染提供科學的依據(jù)，同時也為酰胺類農(nóng)藥對水生植物的毒性效應作出科學的評價。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 浮萍的采集

春季5月份在曲阜沂河中采集的浮萍（Lemna s p p）。

2.1.2 實驗試劑

乙草胺（山東樂邦化學品有限公司生產(chǎn)的50%的乙草胺乳油），丁草胺（營口三征農(nóng)藥廠生產(chǎn)的48% 的丁草胺乳油）。

2.2 實驗方法

2.2.1 浮萍的培養(yǎng)

將采集的浮萍放入已曝氣的澄清自來水中，每天進行適當?shù)墓庹眨?0±2℃下馴養(yǎng)3d。實驗前選取外形完好、形狀和大小都相近的三葉狀萍體作為實驗材料。

2.2.2 毒性實驗的方法

（1）單一毒物毒性實驗。以預備實驗的探究為基礎(chǔ)，確定設(shè)置6個濃度梯度，1個空白對照，以從天然水體中采集的水為溶劑。準備容積為1L的燒杯7個編號為1、2、3、4、5、6和7，在各燒杯中放入含1.02g／mL乙草胺的處理液0mL、0.5mL、1.5mL、3mL、5mL、15 mL和45mL；準備另外的7個容積為1L的燒杯，編號為 A、B、C、D、E、F和 G，在各燒杯中加入1.04g／mL丁草胺的處理液0mL、1mL、1.5mL、4.5mL、10mL、15m和20mL。在每個燒杯中放入240個植物體（80個三葉狀體），在于培養(yǎng)條件相同溫度（20±2℃），相同的光照條件下連續(xù)培養(yǎng)，每隔兩天取樣測定POD的活性，重復三次實驗過程，以保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性。

（2）聯(lián)合毒性試驗。在單一毒性試驗的基礎(chǔ)上，按乙草胺和丁草胺的處理液體積比1∶1進行聯(lián)合毒性試驗，其實驗過程和測試指標的時間間隔和方法與單一毒物毒性實驗完全相同。

2.2.3 酶液的制備

稱取0.1g浮萍放入玻璃研缽中，加適量磷酸緩沖液，快速研磨使其成為勻漿，所得的勻漿轉(zhuǎn)移到50mL的容量瓶中，蒸餾水定容搖勻后，靜置30min，用干濾器濾入干瓶中，并且棄去最初濾下的5～10mL濾液，得到的上清液即為所需的酶液。

2.2.4 POD測定方法

（1）銀標準曲線的繪制。取7支試管，每支試管中分別加入0.5g／L 的硝酸銀溶液0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL和6mL，分別加蒸餾水至8mL混勻，再分別加入0.3%愈創(chuàng)木酚溶液1mL后混勻。將試管置于22℃的水浴鍋中進行水浴加熱，當試管中的溫度達到22℃時開始計時，每間隔1min按編號順序向一個試管中加入3%的過硫酸銨溶液1mL，搖勻后繼續(xù)水浴加熱，直到第一個試管加入過硫酸銨達到15min后，在440nm波長處，以蒸餾水為空白對照，測定第一個試管的吸光度，之后每間隔1min按編號順序測定一個試管中酶液的吸光度，根據(jù)所測的吸光度值繪制標準曲線［10］（圖1）。

圖1 銀標準曲線

（2）POD活性的測定。用移液管精確吸取制備好的酶液1mL，置于干燥試管中，加蒸餾水8mL，混勻后加入1mL0.3%愈創(chuàng)木酚，搖勻，22℃下水浴加熱。當試管中酶液的溫度達到22℃時，加入0.05mol／L的過氧化氫溶液1mL，立即搖勻，繼續(xù)水浴加熱，待加入過氧化氫15min后，在440nm波長下，以蒸餾水為空白對照測定其吸光度值。同時取1mL上清夜，加入9mL蒸餾水，混勻，浸入22℃的水浴中，進行同樣的測定，以作參比液。根據(jù)所測吸光度值在標準曲線上查出對應的Ag濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 POD活性的計算

根據(jù)所測的吸光度值，由銀標準曲線計算出相應的銀濃度C依據(jù)下面公式得出浮萍POD的活性A：

A＝50×10×2.53×C／（15×1×G）＝84.3×C／G

式中A為22℃下POD活性mg／（g×min）；C為由銀標準曲線求得的銀濃度mg／mL；G為制備酶液所取浮萍重量g。

3.2 乙草胺對浮萍過氧化物酶活性的影響

由POD活性計算公式求出乙草胺下列濃度0、2.55mg／L、7.65mg／L、15.3mg／L、25.5mg／L、76.5mg／L和229.5mg／L各作用于浮萍2d、4d、6d和8d時對POD活性的影響如圖2所示。

圖2 乙草胺對浮萍POD活性的影響

由圖2可知，乙草胺對浮萍POD活性的影響與時間和乙草胺的濃度密切相關(guān)。第2天，低濃度時隨濃度的增加POD活性增強，在濃度為7.65mg／L時達到最大值為363.64，之后隨濃度的增加POD活性降低，最終達到穩(wěn)定，原因可能是濃度達到7.65mg／L左右時超過了浮萍的耐受限度使浮萍受到損傷，從而POD活性降低；第4天，POD活性隨乙草胺濃度變化的規(guī)律性并不強，呈現(xiàn)忽高忽低的狀態(tài)，具體原因有待進一步研究；第6天和第7天，濃度低于76.5mg／L時POD活性一直隨濃度增加降低，達到76.5mg／L時POD活性呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，但濃度繼續(xù)增加時POD活性有大幅度的下降，可能是由于長時間接觸高濃度農(nóng)藥使浮萍產(chǎn)生適應性，從而改變了其抗性，而濃度過高又不利于浮萍生存。

從總體來看，實驗初期，低濃度的乙草胺能夠促進浮萍POD的活性，高濃度的乙草胺則抑制浮萍POD的活性，但隨著時間的推移，促進作用逐漸消失，POD的活性表現(xiàn)為逐漸下降；實驗后期，濃度為76.5mg／L的乙草胺對POD活性影響與其他濃度不同，又產(chǎn)生了稍微的促進作用。根據(jù)空白對照計算得出農(nóng)藥對浮萍POD活性的影響率（抑制率或促進率），具體數(shù)據(jù)見表1，表中－表示抑制率；＋表示促進率。

表1 乙草胺對浮萍POD活性的影響率

由上表可以得出，當乙草胺濃度為7.65mg／L時，乙草胺對浮萍POD的激活率最大，為6.29%，當其濃度為229.50mg／L時，乙草胺對浮萍POD的抑制率最大，可達25.28%。乙草胺對浮萍POD活性的影響在濃度低于15.3mg／L時總體表現(xiàn)為在第2天有不同程度的促進作用，使POD活性高于對照組，隨時間的推移促進作用消失，當濃度繼續(xù)增大促進作用消失。

3.3 丁草胺對浮萍過氧化物酶活性的影響

同乙草胺一樣由POD活性計算公式求出丁草胺下列 濃 度 0、2.496mg／L、3.744mg／L、11.232mg／L、24.96mg／L、37.44mg／L和49.92mg／L各作用于浮萍2d、4d、6d和8d時對POD活性的影響如圖3所示。

圖3 丁草胺對浮萍POD活性的影響

由圖3可知，實驗的第2天和第8天，隨著丁草胺濃度的增加，POD的活性都呈現(xiàn)先增加然后逐漸降低的狀態(tài)，可能的原因是低濃度的丁草胺促進了POD的活性，而濃度增加到一定程度又反過來抑制POD的活性；第4天，隨著丁草胺濃度的增加，POD的活性逐漸降低，可能的原因是浮萍尚未適應所處的丁草胺的環(huán)境；第6天，隨丁草胺濃度的增加，POD的活性先增后減，然后再增加，最后逐漸減小，可能的原因是對環(huán)境的適應能力存在個體間的差異，導致所測的數(shù)據(jù)沒有規(guī)律可循。

總的來說，丁草胺對POD的活性的影響隨著丁草胺濃度的增加基本呈現(xiàn)先增加然后逐漸降低的趨勢，由此可知，低濃度的丁草胺可以促進POD的活性，而高濃度的丁草胺則抑制POD的活性。根據(jù)空白對照計算得出農(nóng)藥對浮萍POD活性的影響率（抑制率或促進率），具體數(shù)據(jù)見表2，表中－表示抑制率；＋表示促進率。

表2 丁草胺對浮萍POD活性的抑制率

根據(jù)表2可得，當丁草胺濃度為2.50mg／L時，丁草胺對浮萍POD的激活率最大，為22.68%，當其濃度為37.44mg／L時，丁草胺對浮萍POD的抑制率最大，可達22.68%。在濃度為2.50mg／L和3.74mg／L時，除第4天均表現(xiàn)為促進作用，濃度增大后基本表現(xiàn)為抑制作用。

3.4 乙草胺－丁草胺復合污染對浮萍過氧化物酶的活性影響

同乙草胺、丁草胺單獨作用于浮萍一樣，由POD活性計算公式求出乙草胺－丁草胺復合作用下浮萍在2 d、4d、6d、8d相應的POD活性值如圖4所示。

圖4 乙草胺－丁草胺對浮萍POD活性的影響

由圖4曲線可以看出，在實驗的第2天、第4天、第6天，隨著乙草胺－丁草胺混合濃度的增加，POD活性逐漸降低，但當濃度增加到76.5mg／L時POD活性又有增加的趨勢，可能的原因是高濃度的乙草胺和丁草胺相互作用從而促進了POD的活性，但隨著時間的推移促進的幅度降低；第8天，在混合濃度為15.3mg／L和76.5mg／L處，都對POD活性產(chǎn)生促進作用，但前者促進的幅度較后者大，可能的原因是隨著時間的推移，浮萍對環(huán)境的適應能力增強，從而使得在較低混合濃度處也對POD活性產(chǎn)生促進作用。

從整體來看，隨著乙草胺－丁草胺混合濃度的增加，POD活性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而在高濃度時，卻對POD活性起促進作用，可能的原因是高濃度的乙草胺和丁草胺都對POD活性起抑制作用，但兩種作用是拮抗關(guān)系相互抑制，從而降低了抑制的程度。根據(jù)空白對照計算得出農(nóng)藥對浮萍POD活性的影響率（抑制率或促進率），具體數(shù)據(jù)見表3，表中－表示抑制率；＋表示促進率。

表3 乙草胺－丁草胺對浮萍POD活性的抑制率

由表3可知，乙草胺－丁草胺的復合污染對浮萍POD的活性基本上為抑制作用，且當乙草胺濃度為229.5mg／L，丁草胺濃度為49.92mg／L時，乙草胺－丁草胺對浮萍POD活性的抑制率最大可達32.54%；當混合濃度分別15.30～11.23mg／L，在第8天呈現(xiàn)出最低抑制率僅為0.15%。隨時間及濃度的改變，并沒有很強的規(guī)律性，可能是由于兩種農(nóng)藥相互作用的結(jié)果。

4 結(jié)語

（1）根據(jù)試驗結(jié)果得出丁草胺對浮萍的毒性大于乙草胺。一般表現(xiàn)為低濃度時有促進作用，濃度增加后促進作用逐漸消失，當濃度增加到一定程度又會表現(xiàn)相對的抑制作用減弱，甚至會出現(xiàn)促進作用。

（2）乙草胺－丁草胺的復合污染對浮萍POD的活性的影響在高濃度時表現(xiàn)出拮抗作用，各復合濃度的影響基本表現(xiàn)為抑制作用，具體的數(shù)據(jù)規(guī)律性并不強，可能是由于農(nóng)藥之間的相互作用，有待進一步的研究。

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