呋喃西林代謝物多克隆抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附分析方法

任海濤，沈玉棟，徐振林，楊金易，雷紅濤，肖治理，王 弘，孫遠(yuǎn)明

（廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

呋喃西林代謝物多克隆抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附分析方法

任海濤，沈玉棟，徐振林，楊金易，雷紅濤，肖治理，王 弘，孫遠(yuǎn)明*

（廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

為了建立檢測呋喃西林代謝物（SEM）的酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA），將所設(shè)計合成的系列半抗原與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)制備免疫原并免疫新西蘭大白兔，篩選獲得源于新穎半抗原H3的具有高親和力、高特異性抗SEM多克隆抗體。同時，基于設(shè)計合成的系列同/異源包被抗原，考察了不同結(jié)構(gòu)包被原對ELISA靈敏度的影響，發(fā)現(xiàn)H4-OVA作為異源包被原建立SEM的ELISA檢測方法可獲得最佳的檢測效果，結(jié)果顯示：ELISA方法的半抑制濃度（IC50）為12.37ng/mL；定量檢測線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.439～110.78ng/mL；檢測限（IC10）達(dá)0.07ng/mL，達(dá)到了國內(nèi)外相關(guān)檢測限量要求，可應(yīng)用于實際食品樣品檢測。

硝基西林，半抗原設(shè)計，多克隆抗體，異源包被，ELISA（酶聯(lián)免疫吸附分析）

呋喃西林是一種硝基呋喃類藥物，代謝快速，代謝物為1-氨基脲（SEM）。近些年來廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)類和禽類養(yǎng)殖[1]。但因其代謝物具有三致作用（致癌、致畸性、致突變），對人體健康與生態(tài)平衡造成潛在威脅[2]。歐美和我國先后都明文規(guī)定動物源性食品中呋喃西林不得檢出[3]。由于呋喃西林在動物體內(nèi)分解迅速，其原位穩(wěn)定性只有數(shù)小時，因此檢測呋喃西林母體就顯得沒有意義，然而其代謝物與組織蛋白結(jié)合可以形成穩(wěn)定的化合物，故有必要檢測呋喃西林代謝物[4]。目前國內(nèi)外報道的對食品中硝基呋喃類藥物檢測主要是通過對SEM進(jìn)行衍生化處理后（NPSEM），采用液/質(zhì)聯(lián)用分析法（LC-MS）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和免疫學(xué)方法等進(jìn)行檢測[5-7]。但因為儀器法操作復(fù)雜、檢測成本高、且難以滿足現(xiàn)場大批量樣品的快速檢測要求。酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA）因其靈敏、簡便且可以高通量篩選樣品，目前已經(jīng)發(fā)展成一種普遍的快速檢測篩選方法。Cooper等人建立了基于多克隆抗體的酶聯(lián)免疫方法檢測呋喃西林殘留，其ELISA最低檢測限為0.25ng/mL[8]。Gao等人制備的單克隆抗體，建立的ELISA方法IC50為1.3ng/mL[9]。但以上報道沒有針對呋喃西林半抗原設(shè)計進(jìn)行深入研究，沒有對同/異源包被進(jìn)行比較和優(yōu)化。因此，本工作擬通過設(shè)計及合成的系列半抗原，通過半抗原偶聯(lián)蛋白制備抗SEM多克隆抗體，同時考察不同結(jié)構(gòu)包被原對ELISA方法靈敏度的影響，旨在建立SEM的靈敏、快速的ELISA檢測方法，為開發(fā)相應(yīng)ELISA試劑盒提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性新西蘭大白兔 廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心；呋喃西林衍生物 本實驗室自制；牛血清蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG4000 美國Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體 武漢博士德生物公司；其它化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

MK3多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；HP1100液質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent公司；DRX-600核磁共振儀 德國Burker公司；UV-1640A紫外-可見光掃描儀 日本Kyoto公司；6K-15高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 半抗原合成 半抗原H1和H4：1mmol乙醛酸（H1）、醛基苯甲酸（H4）分別與SEM于10mL甲醇中室溫反應(yīng)2h后，過濾溶液中沉淀。水、甲醇洗滌沉淀，烘干得H1和H4。

H1：MS（ESI negative）m/z：131[M-H]-，1H-NMR（600MHz，d6-DMSO，TMS）：δ5.41（s，1H）；4.66（t，J= 6.8Hz，2H）；2.62（t，J=8.0Hz，2H）。

H4：MS（ESI negative）m/z：206[M-H]-，1H-NMR（600MHz，d6-DMSO，TMS）：δ10.42（s，1H）；7.92（d，J= 8.4Hz，1H）；7.88（s，1H）；7.83（d，J=8.4Hz，1H）。

半抗原H2：氯乙酸鈉1.1mmol、對羥基苯甲醛1mmol于10mL的0.1mol/L NaOH溶液中90～95℃下反應(yīng)5h。冷卻后用0.5mol/L稀鹽酸調(diào)pH。過濾出現(xiàn)的沉淀用乙酸乙酯洗滌并轉(zhuǎn)至分液漏斗，水洗后分離乙酸乙酯相，乙酸乙酯-石油醚（8∶1）重結(jié)晶。水洗、烘干得FPAA[10]。FPAA與SEM合成H2方法同H1。

H2：MS（ESI negative）m/z：236[M-H]-，1H-NMR（600MHz，d6-DMSO，TMS）：δ10.09（s，1H）；7.78（s，1H，）；7.64（d，J=9.0Hz，2H）；6.91（d，J=9.0Hz，2H）；4.71（s，2H）。

半抗原H3：DMF 10mL（除水）、對羥基苯甲醛1mmol于-5℃下加入NaH 2mmol?；靹蚝蟮渭愉宥∷嵋阴?mL，室溫反應(yīng)過夜。加0.5g NaOH和20mL甲醇，60℃下反應(yīng)2h后蒸發(fā)甲醇。飽和NaHCO3溶液、乙酸乙酯洗滌后分離水相，0.5mol/L稀鹽酸調(diào)pH至析出沉淀并過濾，水洗，烘干得FPBA，F(xiàn)PBA與SEM合成H3方法同H1。

H3：MS（ESI negative）m/z：265[M-H]-，1H-NMR（600MHz，d6-DMSO，TMS）：δ12.16（s，1H）；10.10（s，1H）；7.79（s，1H）；7.64（d，1H，J=8.8Hz）；6.94（d，1H， J=8.8Hz）；6.43（s，1H）；4.02（t，1H，J=6.4Hz）；2.40（t，1H，J=7.3Hz）；1.95（t，1H，J=6.9Hz）。

圖1 半抗原合成圖Fig.1 Hapten synthesis map

1.2.2 抗原制備及鑒定 SEM半抗原均采用活潑脂法制備免疫原H2-BSA、H3-BSA和包被原H1-OVA、H2-OVA、H3-OVA、H4-OVA。同時采用戊二醛法制備包被原H5-OVA。制備及鑒定方法參考文獻(xiàn)[11-12]進(jìn)行。

1.2.3 免疫程序 采用免疫原H2-BSA、H3-BSA免疫雌性新西蘭大白兔，100μg/只，首次免疫后間隔1個月加強免疫，以后每隔14d加強免疫。每次免疫后第7d取血并采用棋盤滴定法測定抗血清的效價及靈敏度。操作方法參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。最后一次免疫后心臟采血獲得抗血清，于4℃下放置過夜并高速離心分離血細(xì)胞，將獲得的抗血清分裝，加0.1%的疊氮鈉于-76℃環(huán)境下保存。

1.2.4 ELISA方法的建立 篩選出免疫后制備的最優(yōu)抗血清，依次進(jìn)行不同包被原-抗血清組合并找出最優(yōu)的包被原-抗血清組合，基于最優(yōu)的組合進(jìn)一步完善ELISA工作各條件，通過比較Abs450nm/IC50的值大小獲得最優(yōu)條件[14]，進(jìn)行包被原濃度、抗體反應(yīng)時間、緩沖溶液體系及濃度、pH等條件的優(yōu)化。最終采用最佳ELISA工作條件，以SEM衍生物（NPSEM）濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以B/B0（B為添加藥物時的吸光值，B0為不添加藥物時的吸光值）為縱坐標(biāo)，按照B/B0-logC四參數(shù)對數(shù)擬合繪制最優(yōu)包被原條件下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]并計算ELISA的半抑制濃度（IC50）、線性檢測范圍（IC20～I(xiàn)C80）、最低檢測限（IC10）。

1.2.5 抗體特異性 以SEM衍生物（NPSEM）及其結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行間接競爭ELISA，以下式計算交叉反應(yīng)率：

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原/抗原設(shè)計、合成及鑒定

設(shè)計合成了2個用于免疫的半抗原，5個用于包被的半抗原。設(shè)計的免疫原選擇在能充分暴露SEM特征結(jié)構(gòu)的苯環(huán)對位分別引入2個、4個碳原子長度手臂，可以最大限度暴露待測母體結(jié)構(gòu)，增強免疫原性。同時苯環(huán)的存在使手臂增加了其剛性結(jié)構(gòu)，使得特征結(jié)構(gòu)不至于被蛋白包埋從而起到增強免疫的效果。為了探討抗原抗體識別機制，設(shè)計了5個不同結(jié)構(gòu)的包被原用于免疫分析，其中H2-OVA、H3-OVA為其對應(yīng)免疫原的同源包被，H1-OVA、H4-OVA、H5-OVA為異源包被。異源包被中H1-OVA、H5-OVA因為沒有連接苯環(huán)間隔臂而呈現(xiàn)出與免疫半抗原更大的差異。符合異源包被的設(shè)計思路[16]。

合成的所有半抗原其質(zhì)譜、核磁共振波譜數(shù)據(jù)經(jīng)分析均能正確歸屬并與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)一致，表明半抗原合成成功?？乖贤鈷呙璧慕Y(jié)果也明顯可以看出，相應(yīng)半抗原和載體蛋白比較，偶聯(lián)后的全抗原的最大紫外吸收峰在210～230nm和270～285nm波長范圍內(nèi)變化明顯，證明抗原合成成功。

2.2 抗體特性的鑒定

固定包被原濃度為1μg/mL，ELISA測定抗血清效價，結(jié)果顯示H3-BSA免疫后產(chǎn)生的抗血清效價高于H2-BSA免疫后產(chǎn)生的抗血清（如圖2，圖3）。制備的4個碳原子手臂長度半抗原H3-BSA免疫應(yīng)答優(yōu)于2個碳原子手臂長度的半抗原H2-BSA，說明蛋白與半抗原偶聯(lián)間隔臂為4個碳原子的長度適宜，與蛋白偶聯(lián)后并沒有被蛋白的三維結(jié)構(gòu)掩蓋，單羧酸手臂與苯環(huán)組合形成了剛性的手臂結(jié)構(gòu)，從而可以支撐起半抗原的決定簇[17]。同時設(shè)計的手臂位于重要特征官能團(tuán)的遠(yuǎn)端，利于誘導(dǎo)動物產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答效應(yīng)。

圖2 H2-BSA血清效價圖Fig.2 Serum titer of H2-BSA

圖3 H3-BSA血清效價圖Fig.3 Serum titer of H3-BSA

確定最優(yōu)抗血清后，ELISA測定不同包被原對ELISA靈敏度的影響并選用最優(yōu)的抗體-包被原組合（如表1）。結(jié)果顯示異源包被H4-OVA與免疫原H3-OVA的組合測得的Abs450nm/IC50最高，故在進(jìn)一步的優(yōu)化當(dāng)中選用異源包被H4-OVA。

2.3 ELISA方法的建立

對包被原濃度、抗體反應(yīng)時間、緩沖溶液體系及濃度、pH等工作條件進(jìn)行優(yōu)化。通過比較Abs450nm/IC50的大小獲得最優(yōu)條件（如圖4）。包被濃度和緩沖溶液對ELISA影響明顯，說明高或低的包被原濃度都是不適合的，濃度低時包被原量不足，板孔內(nèi)可供抗體結(jié)合的抗原決定簇少；濃度高時易產(chǎn)生空間位阻導(dǎo)致供抗體結(jié)合的有效抗原決定簇少，都會降低靈敏度。再次，PBS緩沖溶液為最優(yōu)，說明此緩沖溶液的離子強度有利于改善ELISA的工作條件。pH則主要影響抗體和酶的等電點，從而影響抗原抗體的相互作用[18]。最終確立的最佳ELISA工作條件為：包被抗原濃度為50ng/mL、抗體反應(yīng)時間為40min、酶標(biāo)抗體反應(yīng)時間為30min、最優(yōu)緩沖溶液體系為0.05mol/L pH為7.1的PBS緩沖溶液。

圖4 不同工作條件對ELISA方法靈敏度的影響Fig.4 Effect of different conditions on ELISA sensitivity

2.4 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

基于上述最佳ELISA工作條件，以50ng/mL H4-OVA為異源包被原，建立了檢測SEM衍生物的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示（如圖5）：IC50為12.37ng/mL（SEM相對應(yīng)量4.46ng/mL），定量檢測線性范圍為（IC20～I(xiàn)C80）0.439～110.78ng/mL（SEM相對應(yīng)量0.158～39.94ng/mL），檢測限為0.07ng/mL（SEM相對應(yīng)量0.025ng/mL）。

圖5 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 ELISA standard curve

2.5 包被原對ELISA靈敏度的影響

基于上述最佳ELISA工作條件，考察了不同包被原包被，ELISA測定了抑制情況（如表2），結(jié)果顯示：只含待測物質(zhì)對象SEM特征結(jié)構(gòu)片段的異源包被H1-OVA和H5-OVA因為剔除了苯環(huán)僅保留了SEM特征結(jié)構(gòu)，造成了抗體識別困難。說明雖然合理的異源包被能在不降低特異性的基礎(chǔ)上大幅度提高方法靈敏度，但是在設(shè)計異源包被時也要保證與抗體間的親和力，不能過高更不宜過低。同時，結(jié)果顯示未剔除苯環(huán)的異源包被H4-OVA靈敏度更優(yōu)，進(jìn)一步驗證了異源包被與抗體的親和力適中才能提高ELISA檢測的靈敏度。而同源包被H3-OVA上的半抗原結(jié)構(gòu)和抗體識別的主體骨架結(jié)構(gòu)相同，從而造成ELISA檢測的靈敏度不高[19]。因此，最終本文選擇H4-OVA作為最佳ELISA方法的包被原。

表2 不同包被原對ELISA檢測靈敏度的影響（ng/mL）Table 2 Effect of different package antigen on ELISA sensitivity（ng/mL）

2.6 方法特異性

表3 多克隆抗體ELISA方法特異性測定Table 3 ELISA specificity determination on polyclonal antibody

選用最優(yōu)包被原H4-OVA，最優(yōu)ELISA工作條件下測定各藥物的IC50并進(jìn)一步計算交叉反應(yīng)率（CR）。結(jié)果顯示抗體對其它硝基呋喃藥物及結(jié)構(gòu)類似物均無交叉反應(yīng)，特異性良好（如表3）。唯一出現(xiàn)交叉反應(yīng)的是呋喃西林原藥，但作為檢測呋喃西林代謝物的方法，檢測其代謝物最終也是為了說明呋喃西林原藥的使用與否，因此與原藥的交叉并不會影響到對監(jiān)測結(jié)果的判定。

3 結(jié)論

針對呋喃西林代謝物（SEM），通過設(shè)計合成的新穎免疫半抗原H3，成功制備了具有高特異性、高親和力的抗SEM多克隆抗體。其次，通過不同的抗體-包被原組合，從5種包被原中篩選出最優(yōu)的異源包被原H4-OVA。基于此優(yōu)化ELISA工作條件并建立了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。同時，討論了包被原對ELISA靈敏度的影響。最終，測定了ELISA方法的特異性并成功建立了靈敏度高的SEM異源ELISA檢測方法，此方法檢測靈敏度和定量線性范圍均達(dá)到國內(nèi)外相關(guān)檢測限量要求，為食品中非法添加呋喃西林造成的食品安全問題提供了技術(shù)保障，為進(jìn)一步開發(fā)、研制其快速檢測試劑盒提供了理論基礎(chǔ)。

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Production and identification of polyclonal antibody detect nitrofurazone metabolite and development of enzyme-linked immunosorbent assay

REN Hai-tao，SHEN Yu-dong，XU Zhen-lin，YANG Jin-yi，LEI Hong-tao，XIAO Zhi-li，WANG Hong，SUN Yuan-ming*
（Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province，College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

In order that a method of Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method was established to detect nitrofurazone metabolite（SEM），series haptens were synthesized and coupled to bovine serum albumin（BSA）as immunogen which was used to immunize New Zealand white rabbit.An anti-SEM PcAb original from new hapten-H3was obtained and was highly specific to SEM.Effect of ELISA method sensitivity on the different structure coating antigen（homology/heterologous）was inspected.ELISA detection method against SEM could achieve the best result on account of heterologous feature structure H4-OVA.Results showed：half inhibiting concentration（IC50）was 12.37ng/mL，the quantitative detection linear range（IC20～I(xiàn)C80）was 0.439～110.78ng/mL，and the limit of detection limit（IC10）was 0.07ng/mL for ELISA method，which made it met requirement of relevant detection limit at home and abroad and could be applied in the actual demand of food samples detection.

nitrofurazone；Hapten design；polyclonal antibody；heterogenous package；ELISA

TS207.3

A

1002-0306（2012）05-0330-05

2011－05－03 *通訊聯(lián)系人

任海濤（1984-），男，碩士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

國家自然科學(xué)基金（30901005）；廣東省科技計劃項目（2009B011300005，2010A090200084，2009B090300409）；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校長基金(5100-K08198)。