源于雞蛋清溶菌酶ACE抑制肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

饒勝其，劉鋒鋒，居 濤，徐雯琪，楊嚴(yán)俊1，，*

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；3.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

源于雞蛋清溶菌酶ACE抑制肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

饒勝其1，2，3，劉鋒鋒2，居 濤2，徐雯琪2，楊嚴(yán)俊1，2，*

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；3.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

利用胃腸消化酶系水解疏水性氨基酸含量高的蛋清溶菌酶蛋白，篩選能抗胃腸消化的高活性ACE抑制肽。通過(guò)超濾、制備型反相高效液相色譜（RP-HPLC）、分析型RP-HPLC純化、氨基酸組成分析及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF-TOF-MS），從胃腸消化水解液中分離鑒定出兩種ACE抑制肽Lys-Val-Phe（KVF）和Trp-Ile-Arg（WIR），化學(xué)合成該兩種三肽后，ACE抑制活性測(cè)定結(jié)果顯示其IC50值分別為14μmol/L與88.5μmol/L。研究結(jié)果表明，蛋清溶菌酶蛋白來(lái)源的ACE抑制肽有望用于高血壓的預(yù)防與治療。

溶菌酶，ACE抑制肽，分離純化，質(zhì)譜

ACE抑制肽是一類能降低人體血壓的小分子多肽，通常為2～12個(gè)氨基酸殘基，是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的抑制劑，可通過(guò)抑制體內(nèi)血管緊張素Ⅱ和促進(jìn)紓緩激肽的生成達(dá)到降低血壓的目的[1]。自從Ferreira等[2]首次從蛇毒中發(fā)現(xiàn)了一種具有ACE抑制活性的肽以來(lái)，降血壓肽的研究已引起了各國(guó)研究學(xué)者的興趣，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，人們已通過(guò)不同提取方法（天然產(chǎn)物的直接提取、微生物發(fā)酵及蛋白酶水解法等），利用多種生化分離技術(shù)（超濾、凝膠色譜、離子交換色譜或RP-HPLC制備色譜等），結(jié)合目標(biāo)肽的氨基酸組成與質(zhì)譜分析，現(xiàn)已分離鑒定出多種結(jié)構(gòu)、序列及長(zhǎng)度大小不一的ACE抑制肽[3-5]，其中90%以上的ACE抑制肽都來(lái)源于蛋白的酶解產(chǎn)物。但是體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，只有能抵抗胃腸消化酶消化（如LHLPLP[6]、IQP[7]、VPP與IPP[8]等）或能被胃腸消化酶（如KVLPVPQ[9]等）或ACE酶（如VWIS[10]、LKPNM[11]等）降解成更小片段的、依然具有甚至更強(qiáng)ACE抑制活性的肽段才具有體內(nèi)降壓效果，此類ACE抑制肽（也可以稱為降壓肽）是廣大學(xué)者研究的重點(diǎn)。近年來(lái)，盡管研究學(xué)者已從雞蛋蛋白中鑒定出不同長(zhǎng)度的ACE抑制肽[12-15]，但是由于溶菌酶在雞蛋總蛋白中所占比例?。ú坏?%），屬于低豐度蛋白，篩選時(shí)很容易被漏掉。經(jīng)過(guò)氨基酸序列組成分析，溶菌酶蛋白序列具有高比例的疏水性氨基酸與堿性氨基酸，適合篩選ACE抑制肽[16]。本研究利用胃腸消化模擬體系水解蛋清溶菌酶，旨在篩選能抗胃腸消化的高活性ACE抑制肽，發(fā)掘新的活性肽段，擴(kuò)大降壓肽肽庫(kù)，為降壓肽的構(gòu)效關(guān)系及降壓機(jī)理提供活性肽段來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溶菌酶 大連綠雪蛋品發(fā)展有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL） 美國(guó)Sigma公司。

Ultra 15超濾離心管 美國(guó)Millipore公司；紫外分光光度計(jì)UV-2450日本島津公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；真空離心濃縮儀 FABCONCO公司；Waters 1525液相色譜儀、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF-TOF MS） 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外消化模擬 參考Vermeirssen等[17]的方法。稱取200mg高純?nèi)芫阜勰?，?00mL稀的HCl（pH2）溶液重懸溶解，在加酶水解前于80℃恒溫水浴鍋中加熱20min（變性蛋白，使得蛋白結(jié)構(gòu)疏松，易于受到蛋白酶的降解），待冷卻至室溫后，先后用胃蛋白酶（pH2，酶/底物=1/50，w/w）與胰蛋白酶（pH7.5，酶/底物=1/50，w/w）和胰凝乳蛋白酶（pH7.5，酶/底物=1/50，w/w）的復(fù)合酶于37℃各水解5h，并定時(shí)取少量樣品于-20℃凍藏待用，待反應(yīng)完畢后，95℃，加熱15min終止酶反應(yīng)。整個(gè)水解過(guò)程于酶反應(yīng)器中進(jìn)行，且通過(guò)酸堿滴定控制pH。水解液離心并超濾（截留分子量3ku）后，收集濾過(guò)液，凍干，-20℃凍藏。

1.2.2 ACE抑制肽的純化 稱取一定量的酶水解液的凍干粉溶解在超純水中（濃度6mg/mL），經(jīng)脫氣及0.22μm水膜過(guò)濾處理后，上制備柱Sunfire Pre C18column（19×150mm，5μm，Waters）純化。色譜條件如下：流動(dòng)相A為0.065%的三氟乙酸（TFA），流動(dòng)相B為乙腈（含0.05%TFA）；上樣量1mL；流速為7mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm；梯度洗脫條件：0～5min，5%B；5～65min，5%～65%B。分管收集各個(gè)組分峰，于離心真空濃縮儀中蒸干，分別加入200μL超純水重懸溶解，-20℃凍藏。

將ACE抑制活性高且產(chǎn)率高的F8組分進(jìn)一步用分析柱XBridgeTMC18column（4.6mm×150mm）純化。色譜條件如下：流動(dòng)相A為0.065%TFA，流動(dòng)相B為乙腈（含0.05%TFA），上樣量20μL；流速為1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)214nm；梯度洗脫條件如下：0～45min，10%～25%B。收集主要組分，多次上樣并將相同峰合并，后于真空離心濃縮儀中蒸干，加入200μL超純水重懸溶解，-20℃凍藏。

1.2.3 ACE抑制肽的液質(zhì)聯(lián)用（UPLC-MS/MS）鑒定

利用液質(zhì)聯(lián)用鑒定分析型RP-HPLC色譜得到的高ACE抑制活性組分的氨基酸序列。色譜條件為：色譜柱Acquity UPLC BEH C18column（2.1×120mm，1.7μm，Waters）；流動(dòng)相為乙腈/甲酸（流速0.3mL/min）；梯度洗脫條件如下：乙腈在20min內(nèi)濃度由0上升到20%；色譜洗脫出的多肽進(jìn)入基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF-TOF-MS）檢測(cè)。質(zhì)譜條件：質(zhì)量掃描范圍為50～2000m/z；毛細(xì)管電壓為3.5kV；錐孔電壓為30V；單級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜的碰撞能量分別為6eV和20eV；離子源溫度為100℃。采用MassLynx4.1軟件解析MS/MS圖譜及鑒定多肽的氨基酸序列，并將鑒定出的多肽序列與溶菌酶的一級(jí)氨基酸序列進(jìn)行匹配。

1.2.4 ACE抑制率的測(cè)定 樣品ACE抑制率的測(cè)定參考Cushman的方法并稍做改動(dòng)[18]。每個(gè)測(cè)試反應(yīng)的總體積為0.2mL。測(cè)定流程如下：a.于2mL的eppendorf管中加入80μL HHL（溶解在0.1mol/L含0.3mol/L氯化鈉的硼酸鹽緩沖液中，5mmol/L，pH=8.3），加入一定體積的測(cè)試樣品，并用0.1mol/L硼酸鹽緩沖液定容至190μL，將此混合液短暫離心混勻后，放入37℃恒溫水浴中保溫5min；b.逐管加入10μL ACE酶液（3mU），啟動(dòng)反應(yīng)后37℃恒溫保育30min；c.加入0.2mL 1mol/L HCl終止反應(yīng)，再加入1.2mL預(yù)冷（-20℃）的乙酸乙酯，經(jīng)15s振蕩混勻后，4500r/min離心5min，移取0.8mL酯層，轉(zhuǎn)入另一個(gè)離心管中，于真空離心濃縮儀中蒸干（80℃，30min），重新溶于0.8mL的去離子水中，劇烈振蕩混勻后在228nm處測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照管除在反應(yīng)前先加入0.2mL的1mol/L HCl外，其余操作相同。抑制率計(jì)算式如下：

式中：ODB為存在抑制劑時(shí)的吸光值；ODA為不存在抑制劑時(shí)的吸光值（用去離子水代替水解液）；ODC為抑制劑與酶都不存在時(shí)的吸光值（用去離子水代替水解液，并在反應(yīng)前加鹽酸終止反應(yīng)）。ACE抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的肽含量為IC50值。

1.2.5 鄰苯二甲醛（OPA）法測(cè)定肽濃度及蛋白水解度[19]OPA試劑的配制：準(zhǔn)確稱取40mg OPA溶解于1mL甲醇中，分別加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的SDS、25mL濃度為0.1mol/L的硼砂及100μLβ巰基乙醇，用蒸餾水定容到50mL，此為OPA試劑，且使用前即時(shí)配制。用不同濃度的胰酶水解的酪蛋白胨來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，100μL樣品溶液與2mL試劑室溫下反應(yīng)2min，在340nm下比色，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可以得到多肽的含量。蛋白水解度計(jì)算公式如下：

式中：△Abs指被測(cè)樣品在340nm處的吸收值與未水解樣品在340nm處的吸收值的差值；M指被測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量（溶菌酶蛋白分子量為14304u）；d指稀釋倍數(shù)（41）；ε指340nm處的摩爾消光系數(shù)（6000/mol·cm）；C指被測(cè)蛋白的質(zhì)量濃度（2mg/mL）；N表示每個(gè)蛋白分子的肽鍵總數(shù)（128）。

1.2.6 氨基酸組成分析 采用鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生反相高效液相色譜法測(cè)定[20]。將樣品加入6mol/L HCl溶液，真空封口，在1℃下水解24h，冷卻定容、過(guò)濾、蒸干，OPA柱前衍生[脯氨酸與氯甲芴甲酯（FMOC）反應(yīng)]后上氨基酸專用高效液相色譜儀分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s多重分析進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶菌酶的體外模擬消化

為了從溶菌酶蛋白中分離鑒定出能抗胃腸消化的高活性ACE抑制肽，本研究對(duì)高純?nèi)芫高M(jìn)行了胃腸蛋白酶的分步水解。溶菌酶蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解5h后，其水解產(chǎn)物的ACE半抑制濃度（IC50值）就達(dá)到（144.2±1.3）μg/mL，但此時(shí)對(duì)應(yīng)的水解度僅為6.2%。研究報(bào)道溶菌酶高度α螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的抗胃蛋白酶消化性，是導(dǎo)致水解度過(guò)低的原因[21]。

溶菌酶蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解5h后，進(jìn)一步受到腸道消化酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）5h的水解，其終產(chǎn)物的水解度增加至22.5%，IC50值也降低至（15.6±1.4）μg/mL，相對(duì)胃蛋白酶水解液，其ACE抑制活性提高了近10倍。說(shuō)明隨后的腸道消化酶對(duì)于高活性ACE抑制肽的釋放起了決定性的作用，證明這種模擬體內(nèi)消化過(guò)程的分步水解法很適合從食源性蛋白中篩選抗胃腸消化的ACE抑制肽。

2.2 RP-HPLC分離純化ACE抑制肽

圖1 制備型RP-HPLC分離水解液中ACE抑制肽的圖譜Fig.1 Chromatogram of ACE inhibitory peptides from gastrointestinal digestion separated by preparative RP-HPLC

圖2 制備型RP-HPLC收集組分的ACE抑制活性Fig.2 ACE inhibitory activity of fractions obtained from preparative RP-HPLC

水解液經(jīng)制備型RP-HPLC分離后，分步收集了14個(gè)組分，如圖1所示。將收集到的組分離心真空濃縮蒸干溶劑后，分別加入200μL 0.1mol/L硼酸鹽緩沖液（含0.3mol/L NaCl，pH8.3）溶解，并取樣測(cè)定各組分的ACE抑制活性，結(jié)果見(jiàn)圖2。半數(shù)以上組分的ACE抑制率在50%以上，本研究中選擇了產(chǎn)率高且活性最高的F8組分進(jìn)行下一步的分離純化。F8組分經(jīng)分析型RP-HPLC分離后得到兩個(gè)主要組分F8-a與F8-b，重復(fù)上樣，收集并合并相同峰，用離心真空濃縮儀蒸干溶劑，分別加水重懸，檢測(cè)其ACE抑制活性，結(jié)果顯示，F(xiàn)8-a與F8-b組分的ACE抑制率分別為23.2%與91.3%（圖3）。

圖3 組分F8的分析型RP-HPLC分離色譜圖Fig.3 Chromatography of the fraction F8 peptides separated by analytical RP-HPLC

2.3 肽序列分析

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型的軟電離質(zhì)譜，能精確測(cè)定蛋白質(zhì)或多肽的相對(duì)分子量，分析速度快，操作容易，靈敏度和分辨率較高且樣品用量少，同時(shí)結(jié)合液相色譜的聯(lián)用技術(shù)可以提高鑒定多肽物質(zhì)的效率，尤其是當(dāng)各種原理的質(zhì)譜技術(shù)串聯(lián)應(yīng)用時(shí)，不但可以得到多肽的相對(duì)分子量信息，還能對(duì)其序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析[22]。

圖4 組分F8-b的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 MS spectrum of the fraction F8-b

對(duì)F8-b組分進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，如圖4，該組分的一級(jí)質(zhì)譜圖（6eV的低能量碰撞）上出現(xiàn)兩個(gè)豐度最強(qiáng)的的離子峰393.24m/z和474.27m/z，并均具有對(duì)應(yīng)的二聚體離子峰785.53m/z和947.63m/z，據(jù)此判別393.24m/z和474.27m/z為組分F8-b中的兩種主要母離子（A）和（B）。分別選擇該兩種母離子進(jìn)入MALDI-TOF-TOF二級(jí)質(zhì)譜，經(jīng)較高電子能量（本研究中使用20eV）的惰性氣體碰撞后產(chǎn)生多種肽鏈碎片，基于這些碎片及其質(zhì)量數(shù)差值，通過(guò)質(zhì)譜分析的MaxEnt3計(jì)算軟件和PepSeq序列分析軟件即可推斷出該肽段序列。肽鏈在適宜能量碰撞條件下，其碎裂具有一定的規(guī)律，主要在肽主鏈骨架上三種不同的鍵處斷裂，而對(duì)多肽側(cè)鏈化學(xué)鍵的裂解非常微弱，因而肽鏈的斷裂方式和形成的碎片類型表現(xiàn)出相當(dāng)程度的選擇性，可能形成的碎片離子見(jiàn)圖5。其中，酰胺鍵相對(duì)于其它化學(xué)鍵更容易斷裂，因此，b系列離子和y系列離子出現(xiàn)的機(jī)率較大[23]，是解析氨基酸序列的關(guān)鍵離子，其它系列離子可以用于輔助解析肽序列。在本研究中，組分F8-b中兩種母離子（圖4A和圖4B）的二級(jí)質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖6A和圖6B，利用軟件解析得到母離子的氨基酸序列分別為KVY與WIR。從圖6A可看出，序列KVY的bn和yn兩個(gè)系列碎片離子都得到了較好匹配（序列匹配度達(dá)到100%），WIR的yn系列碎片離子也得到了很好的匹配（序列匹配度得到98%），且兩肽序列均與母體蛋白溶菌酶相匹配，分別位于溶菌酶N端序列的f（1-3）與f（123-125）位置。另外，該組分的多肽氨基酸分析的結(jié)果也與質(zhì)譜解析出來(lái)的這兩個(gè)三肽的氨基酸序列組成相吻合，有關(guān)KVY和WIR的結(jié)構(gòu)表征信息見(jiàn)表1。

圖5 肽鏈骨架斷裂及其命名Fig.5 Fragmentation of peptide backbone and the nomenclature

圖6 組分F8-b中主要離子峰的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 MS/MS spectrum of the precursor ions from MS of the fraction F8-b

2.4 ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系

對(duì)鑒定出的兩個(gè)三肽KVF與WIR化學(xué)合成后，進(jìn)行了體外ACE抑制活性測(cè)定，結(jié)果顯示其IC50值分別為14μmol/L與88.5μmol/L。Ondetti等[24]的研究認(rèn)為，C-末端三肽殘基很可能是與ACE活性位點(diǎn)結(jié)合的關(guān)鍵部位，特別是對(duì)疏水性氨基酸殘基（包括芳香族與帶支鏈的脂肪族氨基酸）的親和力較強(qiáng)。Cheung等[25]研究也認(rèn)為，活性較強(qiáng)的ACE抑制肽C-末端氨基酸一般為具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的芳香族氨基酸（如W、Y和F）或脯氨酸。本研究中三肽KVF的C-末端為芳香族氨基酸Phe，而且C末端倒數(shù)第二位置的Val也為疏水的帶支鏈的脂肪族氨基酸，這種序列結(jié)構(gòu)很可能對(duì)于其ACE抑制活性起了關(guān)鍵作用。而且，本研究中的ACE抑制三肽KVF含有同樣或類似的已經(jīng)報(bào)道的二肽序列VF、VW、VY和IW（其IC50分別為9.2、1.4、7.1、2.0μmol/L）[26]，且與油菜籽來(lái)源的RIY（IC50值為28μmol/L）[27]具有很類似的三肽結(jié)構(gòu)，都是N-末端為堿性氨基酸及C-末端為芳香族氨基酸，這類三肽結(jié)構(gòu)很可能易于與ACE的活性位點(diǎn)結(jié)合，從而對(duì)ACE的活性起到抑制作用。也有不與Ondetti和Cheung的ACE抑制模型相一致的，比如C-末端為Arg的AVYPQR、ALPMHIR與ALKAWSVAR，同樣具有很強(qiáng)的ACE抑制活性，其IC50值分別為15、42.6、3μmol/L[28]，Meisel認(rèn)為是Arg上帶正電荷的胍基對(duì)ACE的抑制作用起了重要作用[29]。本研究中分離鑒定出的三肽WIR的C-末端也為Arg，同時(shí)倒數(shù)第二位置為帶支鏈的脂肪族氨基酸Ile及N-末端為疏水性的芳香族氨基酸Trp，這些位置的氨基酸應(yīng)該都貢獻(xiàn)了對(duì)ACE的抑制作用。

3 結(jié)論

總之，本研究通過(guò)體外消化模擬，從溶菌酶蛋白的胃腸消化酶酶解產(chǎn)物中分離鑒定出兩種高活性的ACE抑制三肽KVY和WIR，其IC50分別為14μmol/L與88.5μmol/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶菌酶來(lái)源的ACE抑制肽有潛力被用于預(yù)防與治療高血壓。進(jìn)一步的原發(fā)性高血壓大鼠實(shí)驗(yàn)有待證實(shí)溶菌酶的胃腸消化水解液及本研究中純化鑒定的兩種ACE抑制肽的體內(nèi)降壓效果。

表1 ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)表征Table 1 Structural characterization of ACE inhibitory peptides

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Isolation and identification of ACE inhibitory peptides from the gastrointestinal digests of egg white lysozyme

RAO Sheng-qi1，2，3，LIU Feng-feng2，JU Tao2，XU Wen-qi2，YANG Yan-jun1，2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.School of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，China）

The objective was to screen potent ACE inhibitory peptides，which were resistant to gastrointestinal digestion，from enzymatic hydrolysate of egg white lysozyme by gastrointestinal enzymes.Two angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitory peptide KVF and WIR，were purified from the gastrointestinal digests of egg white lysozyme by centrifugal ultrafiltration，preparative reverse-phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）and analytical RP-HPLC，and identified by matrix assisted laser desorption ionization time of flight tandem mass spectrometry（MALDI-TOF-TOF-MS）based on analysis of amino acids composition.After KVF and WIR was chemically synthesized，ACE inhibitory activities（IC50）of these two tripeptides were determined as 14μmol/L and 88.5μmol/L，respectively.The results suggested that the ACE inhibitory peptides from egg white lysozyme may have potential for use in the prevention and treatment of hypertension.

lysozyme；ACE inhibitory peptide；isolation；mass spectrometry

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）05-0090-05

2011－03－24 *通訊聯(lián)系人

饒勝其（1981-），男，在讀博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA10Z330）。