硝酸酯類槲皮素衍生物的制備及抗氧化活性研究

韋 靜，李芳耀，楊新平，文杜鵑，鄧海東

（1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西桂林541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林541004）

硝酸酯類槲皮素衍生物的制備及抗氧化活性研究

韋 靜1，李芳耀2，*，楊新平2，文杜鵑2，鄧海東2

（1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西桂林541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林541004）

以槲皮素為起始原料，通過(guò)兩步反應(yīng)制備兩種新型硝酸酯類槲皮素衍生物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR及ESI-MS確證，初步考察產(chǎn)物對(duì)DPPH·和·OH自由基的清除性能。結(jié)果表明，兩種槲皮素衍生物對(duì)DPPH·清除率分別為88.7%和90.1%，對(duì)·OH清除率分別為78.6%和80.6%，其IC50分別為4.2、4.5mg/L和19.2、22.3mg/L。

槲皮素，抗氧化活性，衍生物

自由基是人體正常代謝過(guò)程中的產(chǎn)物，其含量過(guò)多或過(guò)少都會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)力，從而導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)受損。研究表明，衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、惡性腫瘤、白內(nèi)障等眾多疾病都與活性氧自由基密切相關(guān)。從中草藥活性成分中尋找和開(kāi)發(fā)具有較強(qiáng)清除自由基作用的低毒抗氧化劑已成為人們研究的熱點(diǎn)[1]。槲皮素是最廣泛存在的一種天然黃酮類化合物，是多種中草藥（如黃芪、絞股藍(lán)、天胡荽和香青蘭等）的有效成分[2-4]。槲皮素具有廣泛的藥理作用和生物活性，如保護(hù)心肌缺血、增強(qiáng)免疫功能及鎮(zhèn)痛等作用，并且還具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗突變、抗癌、抗菌、抗病毒、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生理功能[5-6]，研究表明，槲皮素與某些金屬離子形成配合物后，具有更強(qiáng)的清除自由基活性[7-8]。硝酸酯類化合物具有舒張血管平滑肌、抑制心肌收縮力、抗血小板聚集和抗血栓形成、抗血細(xì)胞黏附、抗血管平滑肌細(xì)胞的增殖、抑制內(nèi)皮素的生成等生物活性[9]，但其抗氧化活性研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道?；谝陨峡紤]，本研究以槲皮素為先導(dǎo)物，通過(guò)不同的碳鏈偶聯(lián)硝酸酯基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了2個(gè)新型硝酸酯類槲皮素衍生物。制備方案如圖1，目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR和MS譜確證，初步研究了產(chǎn)物的體外抗氧化活性。

圖1 目標(biāo)產(chǎn)物的合成路線Fig.1 The synthetic routes of target compounds

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二苯代苦味酰自由基（DPPH·） Sigma公司；其它試劑 均為市售分析純，必要時(shí)經(jīng)無(wú)水處理。

超導(dǎo)核磁共振儀 瑞士Bruck公司；電噴霧質(zhì)譜儀 美國(guó)Bruck公司；TU-1901型雙光路紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ZF7三用紫外分析儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 4′-溴乙氧基槲皮素（1a）和4′-溴丁氧基槲皮素（1b）的制備 將0.75g槲皮素溶解于20mL無(wú)水DMF中，加入2.09g無(wú)水碳酸鉀，常溫下反應(yīng)1h。然后加入1.3mL 1，2-二溴乙烷，升溫至70℃，恒溫反應(yīng)5h，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。然后將燒瓶中的溶液倒入裝有大量冰水的燒杯中，并加入NaCl，抽濾，得到沉淀，柱層析分離得到淡黃色結(jié)晶0.38g，產(chǎn)率為35.2%。同法制備4′-（2-硝基氧基）乙氧基槲皮素（2a），得淡黃色結(jié)晶0.49g，產(chǎn)率為43.1%。

1.2.2 4′-（2-硝基氧基）乙氧基槲皮素（2a）和4′-（2-硝基氧基）乙氧基槲皮素（2b）的制備 將0.72g硝酸銀溶入6.0mL無(wú)水乙腈中，避光，加熱至50℃，迅速加入4′-溴乙氧基槲皮素（1a）0.28g與無(wú)水乙腈的混合液10mL，加畢，升溫至80℃，恒溫反應(yīng)7h，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束，抽濾，濾餅用少量乙腈洗滌，收集濾液并減壓濃縮，得到黃色固體。用柱層析分離得到淡黃色固體0.19g，產(chǎn)率為71.2%。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：4.04（2H，t，-CH2-O），4.23（2H，t，-CH2-ONO2），4.34～4.38（3H，s，5-OH，7-OH，3’-OH），6.40（1H，s，8-CH），6.50（1H，s，6-CH），7.04（1H，s，5’-CH），7.70～7.73（2H，m，1’-CH and 6’-CH），12.62（1H，s，3-OH）；ESIMS m/z：393[M+H]+。同法制備4′-（2-硝基氧基）乙氧基槲皮素（2b），產(chǎn)率為65.3%。δ：1.89～1.94（4H，m，-CH2CH2CH2CH2-），4.03（2H，t，-CH2-O），4.25（2H，t，-CH2-ONO2），4.07～4.45（3H，s，5-OH，7-OH，3’-OH），6.33（1H，s，8-CH），6.42（1H，s，6-CH），7.07（1H，s，5’-CH），7.70～7.74（2H，m，1’-CH and 6’-CH），12.62（1H，s，3-OH）；ESI-MS m/z：421[M+H]+。

1.2.3 DPPH·清除能力測(cè)定 產(chǎn)物對(duì)DPPH·清除作用的測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]的方法。分別將各種不同濃度化合物2a～2b的甲醇溶液0.1mL，加到3.9mL 0.004% DPPH的甲醇溶液中，30min后在517nm處測(cè)其吸光度，同時(shí)測(cè)定DPPH空白溶液的吸光度，每樣品平行測(cè)3次，取其平均值，繪制DPPH·清除率對(duì)化合物濃度曲線，如圖1，計(jì)算半清除率IC50值。

1.2.4 ·OH清除活性測(cè)定 參考文獻(xiàn)[11]，在反應(yīng)體系中加入0.2mol/L、pH=7.4的磷酸緩沖溶液1.0mL，520mg/L的番紅溶液0.2mL，1.0mL EDTA-Fe2+，然后加入不同濃度的樣品試液7.0mL，最后加入6%H2O2溶液0.8mL，混合均勻，在40℃水浴保溫0.5h，在波長(zhǎng)520nm處測(cè)吸光度?？瞻捉M以等體積的去離子水代替樣品溶液；對(duì)照組以等體積的去離子水代替樣品溶液和EDTA-Fe2+溶液，每樣品平行測(cè)3次，取其平均值，繪制清除·OH的活性曲線，如圖2，計(jì)算半清除率IC50值。

2 結(jié)果與討論

設(shè)計(jì)并合成兩個(gè)新型硝酸酯類槲皮素衍生物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR及ESI-MS確證，所合成的2個(gè)硝酸酯類槲皮素衍生物B環(huán)上5′和6′位置的1H-NMR都向低場(chǎng)移動(dòng)，初步確定烴基在4′位取代。將目標(biāo)產(chǎn)物溶解于一定量的甲醇中，測(cè)定試樣的加AlCl3的紫外吸收光譜，然后加入鹽酸再測(cè)，對(duì)比兩次測(cè)定的紫外光譜發(fā)現(xiàn)幾乎沒(méi)有任何變化，充分說(shuō)明了B環(huán)上沒(méi)有鄰二羥基存在，可以確定烴基在4′位取代。

2a和2b的1H NMR譜大部分相差不大，只是2b比2a在化學(xué)位移1.89～1.94ppm處多4個(gè)氫，這是2b比2a多兩個(gè)亞甲基的緣故。2a與1a相比，由于硝基氧基取代了溴，導(dǎo)致原來(lái)與溴相連的亞甲基上的氫向低場(chǎng)移動(dòng)，化學(xué)位移從3.68ppm增為4.23ppm，2b與1b的氫譜也有類似的變化，導(dǎo)致原來(lái)與溴相連的亞甲基上的氫化學(xué)位移從3.66ppm增為4.25ppm，說(shuō)明硝基氧基已經(jīng)取代了溴。

圖2 產(chǎn)物和槲皮素清除DPPH·的活性Fig.2 Scavenging capability of target compounds and quercetin on DPPH free radicals

圖3 產(chǎn)物和槲皮素清除·OH的活性Fig.3 Scavenging capability of target compounds and quercetin on hydroxyl free radicals

目標(biāo)產(chǎn)物2a和2b對(duì)DPPH·清除率分別為88.7%和90.1%，IC50分別達(dá)到4.2、4.5mg/L；對(duì)·OH清除率分別為78.6%和80.6%，IC50分別達(dá)到19.2、22.3mg/L，表明產(chǎn)物均具有較強(qiáng)的清除自由基的能力。槲皮素濃度在50mg/mL時(shí)達(dá)到閾值，繼續(xù)增加其濃度，其清除·OH能力下降[12]。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)槲皮素的結(jié)構(gòu)修飾，得到兩個(gè)硝酸酯類槲皮素衍生物，通過(guò)體外對(duì)自由基的清除作用證實(shí)產(chǎn)物可有效清除DPPH·和·OH，其對(duì)DPPH·和·OH的半清除率均小于槲皮素，分別為4.2、4.5mg/L和19.2、22.3mg/L，其中2b對(duì)·OH清除率分別為80.6%，有望通過(guò)進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾，開(kāi)發(fā)出新型自由基清除劑。

[1]Pan YM，Liang Y，Wang HS，et al.Antioxidant activities of several Chinese medicine herbs[J].Food Chemistry，2004，88（3）：347-350.

[2]石繼亮，單玉，張振秋，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定黃芪中槲皮素、山奈酚、芒柄花素的含量[J].藥物分析，2010，30（1）：114-116.

[3]陳代武，李杰紅.絞股藍(lán)中槲皮素提取條件的優(yōu)化[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（6）：1407-1408.

[4]王祥培，許士娜，吳紅梅，等.天胡荽藥材中槲皮素的薄層鑒別與含量測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（1）：44-45.

[5]舒毅，譚陶，張思宇，等.槲皮素的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].華西藥學(xué)雜志，2008，23（6）：689-691.

[6]王艷芳，王新華，朱宇同.槲皮素藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2003，15（2）：171-173.

[7]吳春，黃梅桂，車春波.槲皮素-鋅（Ⅱ）配合物清除自由基的活性研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（1）：128-129.

[8]謝偉玲，楊培慧，蔡繼業(yè).鍺（Ⅳ）-槲皮素配合物的制備、表征及其抗氧化活性測(cè)定[J].分析化學(xué)，2010，38（12）：1809-1812.

[9]羅剛，陳宇英.硝酸酯類一氧化氮供體藥物研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2010，19（15）：1322-1328.

[10]Larrauri J A，Sanchez Moreno C，Saura Calixto F.Scavenging capaeity of extracts from red and white grape pomace peels[J].J Agriculture Food Chemistry，1998，46（7）：2694-2697.

[11]劉錫建.沙棘果渣總黃酮的提取、精制和抗氧化性能研究[D].北京：北京化工大學(xué)，2004.

[12]Ca0 G，Softc E，Prior R L.Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids：structure-activity relationships[J].Free Redical Biology＆Medicine，1997，22（5）：749-760.

Study on preparation and antioxidant activity of quercetin derivatives coupled with nitrate moiety

WEI Jing1，LI Fang-yao2，*，YANG Xin-ping2，WEN Du-juan2，DENG Hai-dong2
（1.Graduate College，Guilin Medical University，Guilin 541004，China；2.Pharmacy College，Guilin Medical University，Guilin 541004，China）

Two novel quercetin derivatives coupled with nitrate moiety were prepared with alkylene dibromide and AgNO3from quercetin.Their structures were characterized by1H-NMR and ESI-MS.Their capability of scavenging the DPPH·and·OH radicals were evaluated.The preliminary assay results showed that the products possessed strong scavenging activity on reducing power on DPPH·and·OH radicals with maximum scavenging rate 88.7%，90.1%and 78.6%，80.6%，effectively scavenged DPPH·and·OH radicals with IC50of 4.2，4.5mg/L and 19.2，22.3mg/L，respectively.

quercetin；antioxidant activity；derivative

TS201.2

A

1002-0306（2012）05-0095-03

2011－05－26 *通訊聯(lián)系人

韋靜（1979-），女，碩士研究生，講師，研究方向：藥物分子與生物大分子相互作用。

廣西教育廳科研立項(xiàng)項(xiàng)目（201010LX343）；桂林醫(yī)學(xué)院青年教師科研啟動(dòng)基金。