1株非嗜肺軍團(tuán)菌的鑒定

李曲文，原 靈，陳愛平，楊勁松

(福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州350001)

軍團(tuán)菌病是由軍團(tuán)菌感染引起的一種急性細(xì)菌性呼吸道傳染病，該病傳播途徑是經(jīng)呼吸道，以氣溶膠的形式傳播。隨著城市經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，大型建筑物的興建及隨之而來(lái)中央空調(diào)系統(tǒng)、冷卻塔、淋浴設(shè)施等現(xiàn)代化設(shè)備的廣泛使用，人們的暴露機(jī)會(huì)也會(huì)隨著增多，軍團(tuán)菌病流行和暴發(fā)的危險(xiǎn)性也日益增加，目前該病已成為世界各國(guó)及我國(guó)普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。由軍團(tuán)菌引起的疾病有軍團(tuán)菌肺炎、龐蒂亞克熱(Pontiac fever)等，大部分由嗜肺軍團(tuán)菌引起，但非嗜肺軍團(tuán)菌也能引起人類疾病[2]。我省2012年7月從一份中央空調(diào)冷卻塔水中分離出1株疑似非嗜肺軍團(tuán)菌并進(jìn)行了鑒定分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 GVPC平板、BCYE-α 平板、BCYE-cys平板及血平板購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司，在有效期內(nèi)使用。生化反應(yīng)管購(gòu)自北京友康有限公司。軍團(tuán)菌乳膠試劑購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，嗜肺軍團(tuán)菌診斷血清購(gòu)自日本生研。PCR反應(yīng)試劑：Ex Taq 酶、dNTP、10×Buffer、DL 2000 Marker、Wide range DNA Marker(100-6,000)購(gòu)自 Takara 公司，實(shí)驗(yàn)中使用的引物由上海生工合成，瓊脂糖、溴化乙錠(10mg/m1)等購(gòu)自上海生工公司。

1.2 儀器 軍團(tuán)菌培養(yǎng)及鑒定裝置包括：TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)、水平電泳槽、生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、三聯(lián)抽濾裝置 (濾膜 Millipore，0.45μm)。PCR實(shí)驗(yàn)儀器包括：英國(guó)G-Storm PCR儀，上海培清科技有限公司JS-380A自動(dòng)凝膠成像分析儀，Bio-rad公司電泳儀和電泳槽，德國(guó)Sigma1-14離心機(jī)。

1.3 樣品處理與分離培養(yǎng) 參照衛(wèi)生部2006年衛(wèi)生部 《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》及《ISO 11731水樣軍團(tuán)菌檢測(cè)》。將采集的300ml水樣搖勻后，用孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾，將過(guò)濾后的濾膜剪碎于5ml水樣中震蕩洗脫，分別取洗脫液各1ml進(jìn)行酸處理及熱處理，將酸處理及熱處理后的水樣分別取0.2ml分別涂布于GVPC平板上；另將洗脫液不作處理取0.1ml涂布于GVPC平板上；將上述涂布樣品的GVPC平板均置37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)3～10d，3d后，每天觀察平板菌落生長(zhǎng)情況。

1.4 細(xì)菌生化鑒定及分型 在每個(gè)平板上挑取可疑菌落做革蘭染色鏡檢，形態(tài)符合的菌落轉(zhuǎn)種在BCYE-α、BCYE-CYS 和血平板上，置 37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)3～5d，進(jìn)行生長(zhǎng)鑒定試驗(yàn)，第2d生長(zhǎng)的菌不是軍團(tuán)菌，3d后，凡BCYE-α平板上生長(zhǎng)，而BCYE-CYS及血平板上均不生長(zhǎng)的可疑菌落接種生化管，同時(shí)做觸酶試驗(yàn)，生化符合的可疑菌株再進(jìn)行乳膠凝集試驗(yàn)及軍團(tuán)菌診斷血清進(jìn)行血清分型。

1.5 PCR鑒定

1.5.1 DNA模板制備 按常規(guī)PCR檢測(cè)方法進(jìn)行，模板制備(煮沸法)：在生物安全柜中將菌苔(3滿環(huán))輕輕刮至1.0ml Eppendorf離心管中，用0.1ml純水重懸，煮沸 15min后，12000r/min離心 3min，取上清作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的DNA模板。

1.5.2 PCR引物 5srRNA引物序列參考文獻(xiàn)[3],16SrRNA基因引物系列參照中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所舉辦 《軍團(tuán)菌培訓(xùn)班講課資料》,mip基因引物序列參照文獻(xiàn)[4]。引物由上海生工合成。5SrRNA引物序列 F：5’-ACTATAGCGATTTGGAACCA -3’、R: 5’ -GCGATGACCTACTTTCGCAT-3’,片段大小(104bp);16SrRNA 引物序列:F:5’-GAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’、R:5’-CGGTCAACTTATCGCGTTTGCT，片段大小 (430bp)；mip 引物序列：F:5’-GGTGACTGCGGCTGTTATGG-3’、R:5’ -GGCCAATAGGTCCGCCAACG-3’，片段大小(630bp)。

1.5.3 PCR操作程序 反應(yīng)總體積50μl，在PCR管中按順序加入34.0μl純水，10×Buffer(Mg-Cl22.5mmol/L)5.0μl，dNTP(2.5mmol/l)4.0μl，上下游引物 (20μmol/L) 各 1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl，最后加入模板 5.0μl，雙蒸水作試劑空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)株(LP1)由本科室菌種組保存。反應(yīng)條件：(1)5SrRNA基因：94℃預(yù)變性 5min，94℃30s，48℃30s，72℃60s，共 30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 3min；(2)16S rRNA 基因：94℃預(yù)變性5min，94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸 3min；(3)mip基因：94℃預(yù)變性 5min，94℃30s，48℃30s，72℃60s，共30個(gè)循環(huán)，72℃ 延 伸3min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl上樣于1.2%瓊脂糖凝膠中，以DL2000Marker(Wide range DNA Marker(100～6,000))為標(biāo)準(zhǔn)分子量,5V/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度于0.5×TBE電泳緩沖液中電泳40min后,用凝膠成像儀拍照。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征 水樣在GVPC平板上培養(yǎng)3d長(zhǎng)出細(xì)小菌落，培養(yǎng)7d長(zhǎng)出棕褐色、圓形稍凸、濕潤(rùn)光滑菌落，菌落挑起有黏絲狀。

2.2 革蘭染色鏡檢 染色鏡檢為革蘭陰性短桿菌或呈細(xì)長(zhǎng)頭發(fā)絲狀。

2.2 生長(zhǎng)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 將可疑菌落轉(zhuǎn)種BCYE-α、BCYE-CYS 和血平板上，置 37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)3～5d，結(jié)果可疑菌落在BCYE-α平板上生長(zhǎng)，而在BCYE-cys及血平板上均不生長(zhǎng)。

2.4 生化試驗(yàn) 可疑菌落做觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)和接種生化管等試驗(yàn)，結(jié)果為：觸酶陽(yáng)性、明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性；氧化酶、馬尿酸鹽水解、硝酸還原、糖發(fā)酵、尿素酶試驗(yàn)均為陰性。

2.5 血清分型 乳膠凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示本菌株與非嗜肺軍團(tuán)菌乳膠凝集，與嗜肺軍團(tuán)菌乳膠不凝集；用軍團(tuán)菌診斷血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)顯示和嗜肺軍團(tuán)菌血清 L.gormanii、L.micdadei、L.bozemanii和L.dumoffii不凝集。

2.6 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 用軍團(tuán)菌屬特異性基因5SrRNA和16SrRNA，嗜肺軍團(tuán)菌特異性診斷基因mip進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖1。

圖1 PCR鑒定結(jié)果

結(jié)果顯示該菌株5SrRNA基因陽(yáng)性、16SrRNA基因陽(yáng)性，mip基因陰性。

2.7 結(jié)合常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定 血清學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果判定該菌株為軍團(tuán)菌屬非嗜肺軍團(tuán)菌種，血清尚未分型。

3 討論

軍團(tuán)菌病是一種急性細(xì)菌性呼吸道傳染病，具有病程進(jìn)展快，病死率高、易爆發(fā)流行的特點(diǎn)，其病原體軍團(tuán)菌廣泛分布于自然界各種自然水源以及空調(diào)水、管道供水系統(tǒng)等人工水源中，而含有軍團(tuán)菌水產(chǎn)生的氣溶膠是軍團(tuán)菌病主要傳播途徑。國(guó)內(nèi)外對(duì)軍團(tuán)菌的研究證實(shí)軍團(tuán)菌病的流行及傳播與集中空調(diào)、熱水設(shè)備等現(xiàn)代生活設(shè)施的人工水環(huán)境密切相關(guān)[5]。由集中空調(diào)及供水系統(tǒng)引發(fā)的軍團(tuán)菌對(duì)水質(zhì)、空氣的污染已成為當(dāng)今社會(huì)關(guān)注的一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。本文檢出的非嗜肺軍團(tuán)菌是我省首次在冷卻塔水中檢出的非嗜肺軍團(tuán)菌，據(jù)報(bào)道非嗜肺軍團(tuán)菌也能引起人類疾病[2]。

本例為少見的產(chǎn)棕褐色素的軍團(tuán)菌屬，一般軍團(tuán)菌在BCYE上菌落生長(zhǎng)特點(diǎn)以灰白色菌落多見。5SrRNA基因、16SrRNA基因是軍團(tuán)菌的屬特異性基因，mip基因是軍團(tuán)菌的嗜肺軍團(tuán)菌種特異基因。Mahbubani[3]報(bào)道應(yīng)用5SrRNA基因檢測(cè)軍團(tuán)菌屬特異性,可檢測(cè)到104bp基因片段,該序列較為保守,種間差異較小。16SrRNA是微生物核糖體RNA，在物種進(jìn)化中保持相對(duì)的恒定的結(jié)構(gòu)，具有種屬的特異性，因此常作為物種鑒定的基因。鑒于軍團(tuán)菌基因組DNA龐大的數(shù)字,其他方法就無(wú)法對(duì)基因組進(jìn)行分析,需要使用一些具有代表性的序列,所以選擇特異性較高的軍團(tuán)菌種屬特異性序列就具有了重要的意義。16SrRNA和5Sr-RNA可用來(lái)區(qū)分軍團(tuán)菌和非軍團(tuán)菌。mip基因編碼巨噬細(xì)胞感染增強(qiáng)子蛋白,是一種在多種胞內(nèi)寄生菌的細(xì)菌表面均有表達(dá)的外膜蛋白,對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)入到阿米巴和巨噬細(xì)胞有促進(jìn)作用,同時(shí)破壞了細(xì)胞的殺菌功能，mip基因有足夠的序列差異來(lái)區(qū)別嗜肺軍團(tuán)菌與非嗜肺軍團(tuán)菌[6]。5Sr-RNA基因檢測(cè)軍團(tuán)菌屬特異性,可檢測(cè)到104bp基因片段,該序列較為保守,種間差異較小。對(duì)絕大部分軍團(tuán)菌種的16SrRNA序列已被測(cè)定,種間差異比較明顯,可以鑒定大部分軍團(tuán)菌種,但是其變異程度還不足以區(qū)分不同的血清型,目前，已確認(rèn)的軍團(tuán)菌有50種，70多個(gè)血清型，接近20種有臨床分離報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買到的非嗜肺軍團(tuán)菌診斷血清只有四種，檢出的菌落不與其發(fā)生凝聚，結(jié)合分離培養(yǎng)鑒定、血清學(xué)及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果為軍團(tuán)菌屬非嗜肺軍團(tuán)菌種，血清尚未分型。

雖然90%的軍團(tuán)菌爆發(fā)是由嗜肺軍團(tuán)菌引起，但是非嗜肺軍團(tuán)菌引起的病例也時(shí)有發(fā)生。聯(lián)合5SrRNA基因、16SrRNA基因，mip基因能很好的鑒定軍團(tuán)菌屬與非軍團(tuán)菌屬，嗜肺與非嗜肺軍團(tuán)菌。PCR方法靈敏度高，除能檢測(cè)活菌外，還可檢測(cè)已死亡的菌體DNA，因此若水中存在極微量的軍團(tuán)菌或死菌時(shí)，PCR方法能檢出，但傳統(tǒng)分離方法卻是陰性。另PCR引物不但能檢測(cè)致病性軍團(tuán)菌，也能檢測(cè)非致病性軍團(tuán)菌，方法的敏感性高和有高度特異性，與傳統(tǒng)方法吻合率高，適合作為傳統(tǒng)檢測(cè)方法的補(bǔ)充，提高檢測(cè)速度和準(zhǔn)確度。進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定以防漏檢，對(duì)于防范軍團(tuán)菌病的爆發(fā)與流行起了防控作用。

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