一次微生物混合考核盲樣檢測分析

付冬蓮，袁國輝，賴玉珍，周 麗

(南昌市青云譜區(qū)疾病預防控制中心,江西 南昌330006)

近期,江西省技術質量監(jiān)督局受理了我疾控中心提出的實驗室資質認定和食品檢驗機構資質認定二合一的申請，并向我疾控中心檢驗科發(fā)放了微生物考核盲樣,以此來綜合檢測實驗室儀器設備的性能、實驗試劑的質量及技術人員操作能力,此次考核有益于提高檢驗人員的業(yè)務素質和實驗室的檢測能力[1]?，F(xiàn)將我中心檢驗科的盲樣考核結果及檢驗過程報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 由江西省疾病預防控制中心發(fā)放的混合菌盲樣(編號為03號,螺旋小試管內裝腦心浸液肉湯,要求5個工作日內報告盲樣中的病原菌)。

1.2 培養(yǎng)基 、試劑 培養(yǎng)基及生化反應管均由青島高科園海博生物技術有限公司提供;API20E、API Listeria均購自法國梅里埃(上海)生物有限公司，均在有效期內,培養(yǎng)基均經過質量控制，符合質量要求才使用。

1.3 診斷血清 沙門菌診斷血清和志賀菌診斷血清:寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產;均在有效期內。

1.4 檢驗方法 中華人民共和國國家標準GB/T4789-2003、GB/T4789-2008、GB4789-2010、GB4789-2012

2 檢驗方法與步驟

2.1 直接分離培養(yǎng) (以下實驗中所采用的培養(yǎng)溫度均為 36℃，20h，但MYP為30℃48 h)拿到混合菌盲樣時，觀察菌種管有無破損 ，及時進行菌種的分離與鑒定，無菌操作，打開菌種管，首先進行涂片做革蘭染色鏡檢，革蘭染色鏡檢結果是革蘭無芽胞陽性短桿菌和革蘭陰性無芽胞桿菌 ；根據(jù)革蘭染色鏡檢的結果，選用相應的培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、SS、XLD、4 號瓊脂、TCBS 瓊脂、BPK、MYP、沙門菌顯色培養(yǎng)基、志賀菌顯色培養(yǎng)基、O157顯色培養(yǎng)基、李斯特菌顯色培養(yǎng)基、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基，經過16h、36℃培養(yǎng)后觀察結果(其中BPK瓊脂、李斯特菌顯色培養(yǎng)基需48h才能觀察結果)。

2.2 純培養(yǎng) (1)觀察經選擇性瓊脂平板直接分離培養(yǎng)的菌落特征，SS瓊脂平板上有兩種菌落 ：一種無色半透明，圓形，菌落中心帶黑色，另一種為無色半透明菌落；XLD瓊脂平板上有兩種菌落：一種為粉紅色，菌落中心呈現(xiàn)大的黑色中心，另一種為粉紅色菌落；沙門菌顯色培養(yǎng)基平板：一種紫色圓形中等大小菌落，一種白色小菌落；志賀菌顯色培養(yǎng)基：一種為黑色幾乎占滿整個菌落，邊緣為無色的菌落；一種為中心為淡藍色，邊緣為無色的菌落；營養(yǎng)瓊脂：一種為無色中等大小的菌落，一種為稍大些，呈梨型無色菌落；一種為無色稍小的帶黏性，接種環(huán)不易挑取的菌落；血瓊脂平板上有三種菌落：一種為灰白色，中等大小，不透明；一種為灰白色，稍大些，不透明，表面光滑；另一種灰白色，中等大小，不透明,有狹窄溶血環(huán)；挑取營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、SS、XLD、沙門菌顯色培養(yǎng)基、志賀菌顯色培養(yǎng)基上的生長的可疑菌落分別接種于三糖鐵斜面及賴氨酸脫羧酶生化管；其余4號瓊脂、TCBS瓊脂、BPK、MYP、O157顯色培養(yǎng)基、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基均未生長出與選擇培養(yǎng)基對應的可疑菌落。(2)挑取在單核細胞增生李斯特菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)48h的淺藍色的帶暈輪樣落菌落接種于木糖、鼠李糖生化管，同時于TSA-YE平板純化。

2.3 進一步生化反應 (1)三糖鐵斜面36℃、20h觀察形成兩種結果:①革蘭陰性直桿菌，無芽胞，無莢膜:K/AG,底部為黑色；賴氨酸脫羧酶陽性;②革蘭陰性短桿菌，無芽胞，無莢膜：K/A，底部為黃色；賴氨酸脫羧酶陰性；挑?、俚募兣囵B(yǎng)物做靛基質、pH7.2尿素、氰化鉀三項生化；同時挑?、偌阿诩兣囵B(yǎng)物分別接種API20E生化試劑盒。(2)選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物進行革蘭染色、動力、溶血試驗，同時接種API Listeria生化試劑盒。

2.4 生化反應及結果 (1)上述①經API20E生化試驗，生化反應顯示ONPG-ADH+LDC+ODC+CIT+H2S+URE-TDA-IND-VP-GEI-GLU+MAN-INOSOR+RHA-SAC-MEL+AMY-ARA-OX-,結果判定為沙門菌屬(79.0%id，用血清學試驗確證)；觀察靛基質、pH7.2尿素、氰化鉀三項生化，全部為陰性；上述②經API20E生化試驗，生化反應顯示ONPG+ADH-LDC-ODC+CIT-H2S-URE-TDAIND-VP-GEI-GLU+MAN+INO-SOR-RHA+SACMEL-AMY-ARA+OX-結果判定為志賀菌屬(89.0%id，用血清學試驗確證)；同時補做三項生化葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、黏液酸鹽，均為陰性。(2)上述木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物革蘭染色為革蘭陽性短桿菌，用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡下觀察，該菌出現(xiàn)翻滾樣的運動；在SIM動力培養(yǎng)基呈月牙狀生長；在羊血瓊脂平板上刺種周圍產生狹小的透明溶血環(huán)；APIListeria生化反應結果具體見表1,查李斯特菌數(shù)碼圖譜(2510)提示為單核細胞增生李斯特菌。

表1 API Listeria生化反應結果

2.5 血清學分型 取上 述①的純培養(yǎng)物與沙門菌屬診斷血清中的 A～F多價O血清及單因子血清做玻片凝集試驗 ,同時用生理鹽水做對照,血清學分型鑒定結果為腸炎沙門氏菌(1,9,12,g,m);取上 述②的純培養(yǎng)物與志賀菌屬診斷血清中的四種多價血清及分型血清做玻片凝集試驗 ，同時用生理鹽水做對照 ，血清學分型結果為宋內志賀菌I型 ，同時用宋內志賀菌標準菌株做比對,比對結果一致。

3 鑒定結果

綜合以上菌落形態(tài)、染色鏡檢、生化試驗 、血清學分型試驗結果,報告盲樣03號腦心浸液肉湯混合菌樣品檢出腸炎沙門菌和宋內志賀菌I型以及單核細胞增生李斯特菌。實驗結果與省疾控中心的結果完全符合。

4 討論

4.1 本次微生物考核盲樣分離培養(yǎng)首先采用海博顯色培養(yǎng)基，在顯色培養(yǎng)基上生長的紫色的沙門菌菌落、白色的志賀菌落、藍色的單核細胞增生李斯特菌落特征明顯,顏色分明，易于判讀和挑取，可以防止漏檢，同時簡化了檢測步驟，針對性更強。

4.2 考核盲樣往往是2～3株菌株接種于同一樣本中,而考核者接種時又特意加大某種或減少某種菌株的量,制造一定的難度,此次考核樣中沙門菌為優(yōu)勢菌，在SS、XLD、營養(yǎng)瓊脂血瓊脂、沙門菌及志賀菌顯色培養(yǎng)基上的菌落生長遠遠覆蓋了整個平皿，稍不留意，志賀菌落很難被發(fā)現(xiàn)，但因我們平時工作中多加注意識別,不同細菌菌落之間還是有一定區(qū)別的,故被考核者必須嚴格遵守相關標準,認真操作,不可操之過急,注意把握好增菌,分離,培養(yǎng)的時間,將考核工作與平時工作結合起來,把好各個環(huán)節(jié),與平時摸索出的一些微生物生長的特點有機運用起來,使樣品中非優(yōu)勢菌也能被檢出[2]。

4.3 在志賀菌的補充微量生化反應中,我們發(fā)現(xiàn),葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽的試驗應在規(guī)定的48h內看結果，同時要注意掌握接種生化管的菌量要適量，否則會出現(xiàn)判斷失誤。

細菌檢驗質量控制直接關系到細菌學檢測結果的準確性和可靠性,是衛(wèi)生監(jiān)測不可缺少的部分。參加微生物盲樣考核,有利于督促和提高檢驗人員的專業(yè)檢測水平,增加檢驗結果的可靠性和正確性[3]。

[1]紀 靜.一次微生物實驗室室間比對的報告和體會[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2011,29(3):275-276.

[2]李蘇英.盲樣菌株微生物室間質控考核分析[J].浙江預防醫(yī)學,2006,18(1):3.

[3]陳文勝,劉禮怦,羅建波,等.衛(wèi)生微生物實驗室間質量評價的探討[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2004,14(5):624-625.