UrocortinⅠ對缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞鈣離子的影響

張 琳，鄧勝利，姚 剛，喻 田

(遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉系，貴州 遵義 563099)

UrocortinⅠ對缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞鈣離子的影響

張 琳，鄧勝利，姚 剛，喻 田

(遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉系，貴州 遵義 563099)

目的觀察UcnⅠ對成年大鼠缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞鈣離子的影響。方法通過Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)，用Ⅱ型膠原酶逆行灌注法分離成年大鼠心肌細(xì)胞，培養(yǎng)20 h后隨機(jī)分為正常組(N組)、缺氧/復(fù)氧組(I/R組)、UrocortinⅠ組(UcnⅠ組)、5-羥葵酸+UrocortinⅠ組(5-HD+ UcnⅠ組)。各處理組心肌細(xì)胞加入Fluo-3/AM熒光探針，用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光強(qiáng)度。結(jié)果I/R組心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度較N組高(P<0.05)，UcnⅠ組較N組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.01)，而5-HD+ UcnⅠ組心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度與UcnⅠ組比較明顯降低(P<0.05)。結(jié)論UcnⅠ可使成年大鼠缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，5-HD則可阻斷UcnⅠ的作用，提示UcnⅠ導(dǎo)致缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞鈣離子濃度的升高可能跟ATP敏感性鉀通道開放有關(guān)。

缺氧/復(fù)氧損傷；UrocortinⅠ；鈣離子；心肌細(xì)胞

近年來抗心肌缺血再灌注損傷一直是臨床所關(guān)注的熱點(diǎn)，如何減輕心肌缺血再灌注損傷具有重大的臨床意義。UrocortinⅠ是一種含有40個氨基酸并由垂體合成的神經(jīng)肽，目前已經(jīng)證實(shí)UcnⅠ可在心臟中表達(dá)，并能增強(qiáng)心肌收縮力，提高心率，增加心排量，對心血管系統(tǒng)具有強(qiáng)而持久的調(diào)控作用，同時(shí)也具有抗缺血再灌注損傷作用[1,2]，但其具體機(jī)制仍然不清。本實(shí)驗(yàn)擬通過用激光共聚焦顯微鏡，觀察UcnⅠ對缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，來探討UcnⅠ抗缺血再灌注損傷作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級成年SD大鼠,16～20wk，質(zhì)量200～350 g，雌雄不拘,由第三軍醫(yī)大學(xué)提供( SCXK(軍) 2007-017) 。

1.1.2 主要試劑與儀器 Ⅱ型膠原酶(美國Gibco公司)；UrocortinⅠ、5-羥葵酸、EGTA、M199、BSA、層粘連蛋白(美國 Sigma公司)；Fluo-3/AMester(Biotium公司)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。SP2型激光共聚焦顯微鏡(萊卡公司，德國)，全自動數(shù)碼成像與分析系統(tǒng)(GenGenius,Syngene,USA)，MPA離體心臟灌注裝置ALC-B5恒流泵SIGO雙通道灌注儀(上海)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Forma)；純水處理器(美國Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 成年大鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 利用Langendorff離體心臟灌注裝置，成年大鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[3]的方法并加以改進(jìn),主要步驟如下：大鼠腹腔注射3﹪戊巴比妥鈉40 mg·kg-1、肝素50U·kg-1麻醉與肝素化；迅速開胸取出心臟，放入預(yù)冷的750 μM Ca2+液(4 ℃)中輕柔擠壓心臟2～3次；后迅速將主動脈根部固定于Langendorff灌注管口(設(shè)置灌注流量為 9 mL/ min/ g 心臟)；37℃下分別依次逆行灌注充氧的750 μM Ca2+液、無Ca2+EGTA液、Ⅱ型膠原酶液。將灌注后的心臟沿心底向心尖剪下并在無菌搖瓶里加入含有BSA的循環(huán)Ⅱ型膠原酶液，37℃恒溫水浴箱振蕩消化，160鉬濾網(wǎng)過濾，自然沉降后收集細(xì)胞，在沉淀中加入新鮮的酶洗脫液洗脫3次，在培養(yǎng)基中洗脫2次；將沉淀滴片，在相差倒置顯微鏡下行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按鏡下細(xì)胞密度=細(xì)胞數(shù)/毫升原液=(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4)×104×稀釋倍數(shù)；用臺盼蘭進(jìn)行細(xì)胞染色，觀察細(xì)胞活性，有典型橫紋、活力的桿狀細(xì)胞約占80%以上可用于后續(xù)在M199培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞數(shù)以104/cm2的密度平鋪于層粘連蛋白( 37℃0.5 h) 預(yù)處理過的6 孔板中,加入無血清M199 培養(yǎng)3 h 使之貼壁,再小心換液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與各因素處理 細(xì)胞培養(yǎng)20 h后，將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組進(jìn)行處理：正常組(N組)在37℃95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)420 min；缺氧/復(fù)氧組(I/R組)：正常培養(yǎng)60 min后，在95% N2+5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧240 min，再復(fù)氧120 min；UrocortinⅠ組(UcnⅠ組)正常培養(yǎng)30 min+ UcnⅠ(10-8M)30 min；5-羥葵酸+UrocortinⅠ組(5-HD+ UcnⅠ組)5-HD(5×10-9mol/L)30 min+UrnⅠ(10-8M)30 min培養(yǎng)，余處理同I/R組，在95%N2+5% CO2培養(yǎng)箱中缺氧240 min，再復(fù)氧120 min。

1.2.3 共聚焦顯微鏡測定心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度室溫避光條件下，將復(fù)氧后心肌細(xì)胞用Fluo-3/AM (10 mg/L )Ca2+熒光染料在37℃培養(yǎng)箱中負(fù)載約45 min。PBS 液輕柔沖洗細(xì)胞2～3次以洗去多余的熒光染料，通過激光共聚焦顯微鏡，選擇8個不同視野觀察30個細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度，采用激光共聚焦顯微鏡分析軟件測量細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化。

2 結(jié)果

N組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度較低；I/R組心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度較N組強(qiáng)(P<0.05)；UcnⅠ組較N組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.01)；5-HD可拮抗UcnⅠ使細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度降低(P< 0.05)。激光共聚焦顯微鏡下各組心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度見圖1,各組熒光強(qiáng)度數(shù)值比較(見表1)。

表1 缺氧復(fù)氧后各組心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度值

注：與 N組比較,*P<0.05,P<0.01;與UcnⅠ組比較,#P<0.05。

注：A：N組，B：I/R組，C：UcnⅠ組，D：5-HD+ UcnⅠ組。圖1 激光共聚焦顯微鏡下心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度(×400倍)

3 討論

心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧可導(dǎo)致再灌注損傷。目前認(rèn)為其機(jī)制可能與細(xì)胞能量代謝障礙、氧自由基產(chǎn)生、鈣超載等有關(guān)。而鈣超載可能是缺血再灌注損傷的重要原因之一。鈣離子可作為第二信使傳遞細(xì)胞間的信息。在生理狀態(tài)下，細(xì)胞外游離Ca2+濃度為1～2 mmol/L，而胞內(nèi)為10～100 nmol/L左右，并主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)、細(xì)胞核、線粒體和質(zhì)膜上[4]。而心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)平衡主要由以下方式參與調(diào)節(jié)：1、外鈣內(nèi)流，細(xì)胞膜上L型鈣離子通道是電壓依賴性鈣通道，是鈣內(nèi)流的重要途徑，L型鈣離子通道內(nèi)流的鈣占10%～20%；2、肌漿網(wǎng)儲存鈣釋放，心肌細(xì)胞鈣超載主要取決于肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子的釋放，細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+升高80%～90%由肌漿網(wǎng)釋放，舒張期細(xì)胞內(nèi)70%～75%的Ca2+同樣由肌漿網(wǎng)上鈣泵回收儲存[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，UCN在離體和在體試驗(yàn)中發(fā)揮多種心血管作用，如正性肌力作用、抗心衰，提高心率及舒張外周血管、降低血壓，抗缺血再灌注損傷，逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)等[6,7]。本實(shí)驗(yàn)采用離體培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，利用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度，研究結(jié)果顯示：I/R組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度較N組強(qiáng)，說明缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加；UcnⅠ組較N組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說明預(yù)處理UcnⅠ后也能使缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加。但既往有文獻(xiàn)報(bào)道：urocortin后處理可減少缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高[8]。Urocortin還能通過抑制心肌細(xì)胞L型鈣通道的開放抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載[9]。這與我們結(jié)果不同，原因可能是：UcnⅠ可通過抑制心肌細(xì)胞膜上的L型鈣通道開放從而阻止鈣內(nèi)流，但不能作用于心肌細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)本身儲存鈣的釋放，而我們離體培養(yǎng)的成年大鼠心肌細(xì)胞是在無鈣的M199中培養(yǎng)，所以L型鈣通道對細(xì)胞內(nèi)鈣水平并無作用，UcnⅠ處理心肌細(xì)胞后胞內(nèi)鈣離子濃度依然升高。但5-HD可拮抗UcnⅠ的作用使細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度降低，而5-HD是線粒體鉀通道特異性阻斷劑，可說明UcnⅠ對細(xì)胞鈣離子濃度的影響可能與線粒體ATP敏感性鉀通道有關(guān)。Lawrence等[10]通過基因芯片技術(shù)也發(fā)現(xiàn)urocortin無論在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞還是離體心臟，都可使心肌Kir 6.1(ATP敏感性鉀通道亞基)表達(dá)增加，這也證實(shí)了urocortin可通過ATP敏感性鉀通道發(fā)揮其作用。本實(shí)驗(yàn)支持這一推論，但具體的機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，UcnⅠ可使成年大鼠缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，但是否是在保護(hù)范圍內(nèi)升高，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。而5-HD可阻斷UcnⅠ此作用，說明UcnⅠ對鈣離子濃度的影響可能跟ATP敏感性鉀通道開放有關(guān)。

[1] Parkes D G,Vaughan J,Rivier J,et al.Cardiac inotropic actions of urocortin in conscious sheep[J].Am J Physiol,1997,272(52):2115- 2122.

[2]Brar B K,Jonassen A K,Stephanou A,et al.Urocortin protects against ischemic and reperfusion injury via aMAPK dependent pathway[J].Biol Chem,2000,275:8504-8541.

[3]鄧勝利，喻田，文鈺紓，等.成年大鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,31( 6): 587-589.

[4]Zhang Y H,Hancox J C.Regulation of cardiac Na+-Ca2+exchanger activity by protein kinase phosphorylation-still a paradox[J].Cell Calcium,2009,45:1-10.

[5]李悟，李彤，楊景學(xué)，等.家兔未成熟心肌缺血再灌注肌漿網(wǎng)攝鈣功能的初步研究[J]．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003,13(16)：23-25.

[6]A.Phrommintikul,S.Sivasinprasasn,N.Lailerd,et al.Plasma urocortin in acute myocardial infarction patients[J].European Journal of Clinical Investigation,2010,40:874-882.

[7]Takatani-Nakase T,Takahashi K.Cardioprotective activity of urocortin by preventing caspase-independent,non-apoptotic death in cultured neonatal rat cardiomyocytes exposed to ischemia[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,402(2):216-221.

[8]Calderón-Sánchez EM,Ruiz-Hurtado G,Smani T,et al.Cardioprotective action of urocortin in postconditioning involves recovery of intracellular calcium handling[J].Cell Calcium,2011,50(1):84-90.

[9]Tao J,Xu H,Yang C,et al.Effect of uroconin on L-type calcium currents in adult rat ventricular myocytes[J].Pharmacol Res,2004,50: 471-476.

[10]Lawrence K M,Chanalaris A,scarabelli T,et a1.K(ATP)channeI gene expression is induced by urocortin and mediates its cardioprotective effect[J].Circulation,2002,106:1556-1562.

EffectsofUrocortinⅠoncalciumconcentrationinhypoxia/reoxygenation-injuredratcardiomyocytes

Zhanglin,Dengshengli,Yaogang,Yutian.

(Department of Anesthesiology,Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Urocortin I (UcnⅠ) on calcium concentration of cultured adult rat cardiomyocytes after hypoxia/reoxygenation injury.MethodsAdult rat cardiomyocytes were separated and cultured by type II collagenase retrograde perfusion using Langendorff isolated heart perfusion apparatus.Twenty hours later,the cardiomyocytes cells were randomly divided into normal group (N),hypoxia/reoxygenation group (I/R),UrocortinⅠgroup (UcnⅠ) and 5-HD+UrocortinⅠgroup (5-HD+ UcnⅠ).The cultured cardiomyocytes were mixed with Fluo-3/AM fluorescent probe and the calcium concentrations of cultured cardiomyocytes were detected via the confocal microscope.ResultsThe inflorescence intensity of intracellular calcium in I/R and Ucn I groups was higher than that in N group (P<0.05).However,the inflorescence intensity of intracellular calcium in 5-HD+UcnⅠgroup was much lower than that in UcnⅠgroup (P<0.05).Conclusion5-HD could block Ucn I-induced increase of intracellular calcium concentration in the cultured adult rat cardiomyocytes after hypoxia/ reoxygenation injury,suggesting that Ucn I-increased calcium concentration in hypoxia/reoxygenation-injured cardiomyocytes might be related to ATP sensitive potassium channel opening.

Hypoxia/reoxygenation injury; UrocortinⅠ; calcium; cardiomyocyte

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(NO:黔科合J字[2008]2196);遵義醫(yī)學(xué)院科研啟動基金( NO:[2010]448)。

鄧勝利，男，副教授,E-mail:zyds12004@163.com。

R331

A

1000-2715(2012)03-0193-03

[收稿2012-03-24；修回 2012-04-12]

(編輯：譚秀榮)