改良三維條件下人胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化及功能

蘇位君, 王寶玉，宋祥和，王麗娜 ，劉艷華，周曼倩，童玲玲, 李宗金

1南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，天津 3000712南開大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津 300121 3山東省日照市中醫(yī)院心內(nèi)科，山東日照 276800 4南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津 300071 5南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，天津 300071

·論著·

改良三維條件下人胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化及功能

蘇位君1, 王寶玉2，宋祥和3，王麗娜4，劉艷華4，周曼倩4，童玲玲5, 李宗金5

1南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，天津 300071
2南開大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津 3001213山東省日照市中醫(yī)院心內(nèi)科，山東日照 2768004南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津 3000715南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，天津 300071

目的建立一種改良的三維分化無血清方法，對(duì)人胚胎干細(xì)胞(hESCs)向內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分化，并對(duì)這種方法得到的人胚胎干細(xì)胞來源內(nèi)皮細(xì)胞(hESC-ECs)進(jìn)行功能檢測(cè)。方法在低附著培養(yǎng)皿中培養(yǎng)未分化的H9 hESCs 12 d，使其形成類胚體(EBs)，12 d后將已形成的EBs收集起來，用濃度為1.5 mg/ml的Ⅰ型鼠尾膠原重懸，加入六孔板中，在37℃待膠原凝固后加入EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，獲得出芽類胚體后用0.25%膠原酶Ⅰ和0.56 U/ml Liberase Blendzyme消化芽生類胚體各20 min，采用流式技術(shù)分選出其中CD31陽性的細(xì)胞，并用乙?；兔芏戎鞍?ac-LDL)攝取實(shí)驗(yàn)和成管實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這部分細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞功能。結(jié)果建立了一種基于膠原培養(yǎng)環(huán)境的三維分化方法，采用這種方法能夠?qū)ESCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的效率提高到18%，最終獲得的hESC-ECs具有和人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)相似的細(xì)胞表面標(biāo)志物，并在乙?；疞DL吞噬實(shí)驗(yàn)和血管新生實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的內(nèi)皮細(xì)胞功能。結(jié)論建立的改良三維分化方法能夠明顯提高h(yuǎn)ESCs向內(nèi)皮細(xì)胞的分化效率，是一種簡(jiǎn)單高效的分化方法，同時(shí)無血清培養(yǎng)方法為將來hESC-ECs的臨床應(yīng)用提供了可能。

人胚胎干細(xì)胞；人胚胎干細(xì)胞來源內(nèi)皮細(xì)胞；三維分化法；CD31

ActaAcadMedSin，2012,34(6)：539-544

心肌梗死、下肢缺血等心血管疾病是世界范圍內(nèi)致死、致殘的重要疾病。目前的治療方法只能緩解癥狀，不能達(dá)到恢復(fù)壞死灶功能的目的。近年來，有研究者將從臍帶血、骨髓等來源分離得到的內(nèi)皮前體細(xì)胞用于缺血性疾病動(dòng)物模型的治療，并取得一定療效[1-2]，但這些來源的內(nèi)皮前體細(xì)胞均不易獲得且數(shù)量有限。人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)具有無限的自我更新和向各種成體細(xì)胞分化的能力，這使其具有被用作大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞來源的可能性。目前，由hESCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的方式主要分為三維分化法和二維分化法，這兩種方法分別具有分化效率低和容易被鼠源細(xì)胞污染的缺點(diǎn)[3-7]，嚴(yán)重阻礙了其臨床應(yīng)用。本研究采用一種改良的三維分化法，在無血清條件下對(duì)hESCs向內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分化，以期更加安全、高效地獲得大量hESCs來源的內(nèi)皮細(xì)胞(hESC-derived endothelial cells，hESC-ECs)。

材料和方法

材料hESCs H9細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)Wicell研究所，IMDM培養(yǎng)基、EGM-2培養(yǎng)基(Lonza)、KnockoutTM血清替代物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，牛血清白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白(bovine serum albumin, insulin, transferrin，BIT)購(gòu)自美國(guó)Stem Cell Technologies公司，非必需氨基酸、谷氨酰胺、單硫甘油購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，青霉素、鏈霉素、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，Ⅰ型鼠尾膠原購(gòu)自美國(guó)BD公司，0.25%膠原酶Ⅰ、Liberase Blendzyme、鼠抗人CD31抗體、Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司，人纖維連接蛋白購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein，ac-LDL)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購(gòu)自中國(guó)生工公司，甲醇、過氧化氫購(gòu)自中國(guó)天津化學(xué)試劑廠。

hESCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化在低附著培養(yǎng)皿中培養(yǎng)未分化的H9 hESCs 12 d使其形成類胚體(embryonic bodies, EBs)，培養(yǎng)基具體配方為：在IMDM基本培養(yǎng)基中加入15%KnockoutTM血清替代物、1×BIT、0.1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L谷氨酰胺、450 μmol/L單硫甘油、50 U/ml青霉素、50 μg/ml鏈霉素、20 ng/ml bFGF及50 ng/ml VEGF。12 d后，將已形成的EBs收集起來，在冰上用終濃度為1.5 mg/ml 的Ⅰ型鼠尾膠原重懸，加入六孔板中，放入37℃培養(yǎng)箱使膠原凝固。30 min后在凝固的膠原上方加入含有5% KnockoutTM血清替代物、20 ng/ml bFGF和50 ng/ml VEGF的EGM-2培養(yǎng)基。

內(nèi)皮細(xì)胞的分選采用流式細(xì)胞技術(shù)，分別用0.25%膠原酶Ⅰ和0.56 U/ml Liberase Blendzyme消化芽生EBs各20 min，并使消化后細(xì)胞懸液通過40 μm濾膜。用鼠抗人CD31抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，上機(jī)分選出CD31+細(xì)胞，將分選出的細(xì)胞用包被了人纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。

乙?；疞DL(Dil-ac-LDL)攝取實(shí)驗(yàn)用10 μg/ml乙?；疞DL在37℃條件下孵育hESC-ECs 6 h，用PBS洗2遍后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色后封片，在顯微鏡下觀察、拍照。

血管新生實(shí)驗(yàn)將Matrigel加入六孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱使凝固；將用EGM-2培養(yǎng)基重懸的分化后內(nèi)皮細(xì)胞鋪于凝固的Matrigel上，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下觀察、拍照。

整體免疫熒光染色將EBs置于甲醇/DMSO 4∶1混合液中，4℃固定過夜。將固定后的EBs置于甲醇、DMSO和30%過氧化氫的混合溶液(4∶1∶1)中1.5 h，消除內(nèi)源性過氧化物酶的作用，之后將EBs在PBS緩沖液中水化30 min，并用PBSBT(含2%BSA)進(jìn)行封閉，加稀釋后CD31抗體4℃孵育過夜，用PBS沖洗后，加稀釋后熒光標(biāo)記二抗室溫孵育2 h， 沖洗后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核并封片，在顯微鏡下觀察、拍照。

結(jié) 果

hESCs向內(nèi)皮細(xì)胞的分化情況Oct-4和堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示，hESCs呈集落生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密堆積，細(xì)胞間無明顯間隙，集落中大多數(shù)細(xì)胞Oct-4、堿性磷酸酶染色呈陽性(圖1)。將hESCs在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d后，可形成典型的EBs形態(tài)；對(duì)形成的EBs進(jìn)行整體免疫熒光染色，可見EBs中已經(jīng)有部分細(xì)胞已經(jīng)開始表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31；將形成的EBs用Ⅰ型鼠尾膠原重懸，加EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，可見EBs周圍成簇出現(xiàn)新生芽狀結(jié)構(gòu)；對(duì)芽生EBs進(jìn)行整體免疫熒光染色，可見其四周和芽狀結(jié)構(gòu)均表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31(圖2)。

hESC-ECs表面標(biāo)志物的表達(dá)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，未分化hESCs的CD31和CD144表達(dá)水平低，均小于1%；而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(kinase insert domain-containing receptor，KDR)和CD133有相當(dāng)比例的表達(dá)。EBs的CD31和CD144表達(dá)水平較hESCs有所提高，分別達(dá)到3.3%和8.0%；將hESCs置于膠原中培養(yǎng)后得到的出芽EBs表達(dá)CD31和CD144的比例進(jìn)一步升高至18.3%和24.8%。最終分選得到的hESC-ECs除KDR表達(dá)比例低于人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)外，CD31、CD144和CD133表達(dá)均達(dá)到HUVECs的水平(圖3)。

hESC-ECs的功能檢測(cè)結(jié)果由hESCs分化得到的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石樣，與體外培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞基本相同；免疫熒光染色可見hESC-ECs絕大多數(shù)都表達(dá)CD31；Dil-ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)可見分化得到的內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中呈現(xiàn)明亮的紅色熒光，這種分化得到的內(nèi)皮細(xì)胞能夠在Matrigel上形成血管樣條索結(jié)構(gòu)，相互連接(圖4)。

hESCs: 人胚胎干細(xì)胞；Oct-4: 八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-4；ALP:堿性磷酸酶hESCs: human embryonic stem cells；Oct-4: octamer-binding transcription factor 4；ALP: alkaline phosphateA.光鏡下未分化hESCs集落；B.未分化hESCs Oct-4的表達(dá)情況；C.未分化hESCs ALP的表達(dá)情況A.the colony of hESCs; B.the expression of Oct-4 in hESCs; C.the expression of ALP in hESCs圖 1 未分化hESCs表面標(biāo)志物的表達(dá)(×200)Fig 1 Expressions of Oct-4 and ALP in undifferentiated hESCs(×200)

A.光鏡下hESCs在分化培養(yǎng)條件下12 d形成的類胚體 (×200)；B.類胚體CD31的表達(dá)情況，紅色為CD31，藍(lán)色為細(xì)胞核(×200)；C.光鏡下類胚體在膠原條件下培養(yǎng)3 d后形成的出芽類胚體 (×200)；D.出芽類胚體周邊部位CD31的表達(dá)情況 (×400)A.the embryonic body cultured in differentiation medium for 12 days (×200); B.the expression of CD31 in embryonic body, in which red represents CD31 and blue represents nuclei(×200); C. embryonic body-sprouting formed in rat tail collagen type Ⅰ (×200); D.the expression of CD31 in embryonic body-sprouting (×400)圖 2 類胚體和出芽類胚體CD31的表達(dá)情況Fig 2 Expression of CD31 in embryonic body and embryonic body-sprouting

hESC-ECs：人胚胎干細(xì)胞來源內(nèi)皮細(xì)胞；HUVECs：人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞hESC-ECs：human embryonic stem cells-derived endothelial cells；HUVECs: human umbilical vein endothelial cells圖 3 未分化hESCs、類胚體、出芽類胚體、hESC-ECs和HUVECs的CD31、CD144、KDR和CD133表達(dá)比例Fig 3 Expressions of CD31, CD144, KDR and CD133 in undifferentiated hESCs, embryonic bodies, embryonic body-sproutings, hESC-ECs and HUVECs by FACS

A.光鏡下hESC-ECs的形態(tài)；B.hESC-ECs的CD31表達(dá)情況，紅色為CD31，藍(lán)色為細(xì)胞核；C. hESC-ECs對(duì)乙?；疞DL的攝取情況；D. hESC-ECs在Matrigel中形成的管狀結(jié)構(gòu)A.morphology of hESC-ECs; B.expression of CD31 in hESC-ECs, red represents CD31, blue represents nuclei; C. uptake of Dil-ac-LDL by hESC-ECs; D.formation of endothelial tubes by hESC-ECs seeded in 24-well plates coated with Matrigel圖 4 hESC-ECs的體外功能檢測(cè)(×200)Fig 4 Functional characterization of hESC-ECs in vitro(×200)

討 論

胚胎干細(xì)胞是一種未分化的、具有自我更新能力和全能性的細(xì)胞。隨著近年來干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，有越來越多的研究試圖利用胚胎干細(xì)胞分化為各種成體細(xì)胞的能力將其應(yīng)用于醫(yī)學(xué)組織工程。已經(jīng)有多項(xiàng)研究證明了hESCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞的潛力，包括EBs能夠分化為血管樣結(jié)構(gòu)。胚胎干細(xì)胞來源的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于缺血性疾病治療的有效性已經(jīng)在動(dòng)物模型中得到了證明[8]，為將其今后應(yīng)用于臨床治療打下基礎(chǔ)。

以往將hESCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法主要分有三維分化法和二維分化法兩種。Levenberg等[3]在2002年首次采用三維分化法，將hESCs在低附著培養(yǎng)皿中培養(yǎng)9～13d，使其形成EBs，然后將EBs消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，并從中分選CD31陽性細(xì)胞。隨著EBs的分化，內(nèi)皮標(biāo)志物CD31、VE-cadherin和CD34的表達(dá)水平不斷升高，在13～15d時(shí)達(dá)到最高。同樣，本研究在對(duì)EBs的整體免疫熒光染色中也發(fā)現(xiàn)CD31陽性細(xì)胞，且連接成條索狀，提示了EBs能夠自發(fā)地向內(nèi)皮細(xì)胞方向進(jìn)行分化。但這種EBs自發(fā)分化的效率較低，采用流式分選技術(shù)只能分選出2%～3%左右的CD31陽性細(xì)胞。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)只有3.3%的EBs階段細(xì)胞表達(dá)CD31。二維分化法是將hESCs在鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行分化，繞開了形成EBs的步驟，有效地提高了向內(nèi)皮細(xì)胞方向的分化效率[5]。但這種在飼養(yǎng)層上進(jìn)行分化的方法可能會(huì)造成鼠源細(xì)胞的污染，是將來hESC-ECs應(yīng)用于臨床的一個(gè)障礙。鑒于上述2種分化方法各有不足，本研究試圖找到一種無血清、并具有較高效率的改良三維分化方法。

傳統(tǒng)的三維分化法多采用由hESCs形成的EBs分選出內(nèi)皮表面標(biāo)志物陽性的細(xì)胞，但效率較低，本研究采用改進(jìn)后的三維分化法將EBs加入膠原中進(jìn)行培養(yǎng)，使之進(jìn)一步分化得到出芽EBs，并由出芽EBs中分選CD31陽性細(xì)胞。從流式結(jié)果來看，這種方法能夠得到18%左右的CD31陽性細(xì)胞，較傳統(tǒng)三維法效率有了大幅度的提高。本研究在由hESCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的過程中，向培養(yǎng)基中加入VEGF和bFGF細(xì)胞因子，結(jié)果顯示其能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分化，CD144和CD31的表達(dá)上調(diào)。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要骨架成分，有報(bào)道認(rèn)為包括Ⅰ型膠原在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)成分能夠促進(jìn)EBs向成骨細(xì)胞和心肌細(xì)胞方向分化[9-10]。因?yàn)棰裥褪笪材z原在常溫下容易部分凝固，從而導(dǎo)致EBs細(xì)胞不能在膠原中均勻分布，所以涉及膠原的步驟要全程在冰上操作。

總之，應(yīng)用改良后的三維分化法可以有效避免二維分化法中鼠源細(xì)胞的污染，并且將EBs置于Ⅰ型膠原中可以有效提高向內(nèi)皮細(xì)胞方向的分化效率。經(jīng)此方法分選出的CD31陽性細(xì)胞能夠很好的表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物，并具有內(nèi)皮細(xì)胞功能，是一種切實(shí)可行、簡(jiǎn)單高效的由hESCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的方法。

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Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Endothelial Cells via Improved Three-dimension Approach

SU Wei-jun1, WANG Bao-yu2, SONG Xiang-he3, WANG Li-na4, LIU Yan-hua4,ZHOU Man-qian4, TONG Ling-ling5, LI Zong-jin5

1Department of Pathology, Nankai University School of Medicine, Tianjin 300071, China2Department of Endocrinology, Nankai University People’s Hospital, Tianjin 300121, China3Department of Cardiology, Rizhao Hospital of Traditional Medicine, Rizhao, Shandong 276800,China4Department of Immunology, Nankai University School of Medicine, Tianjin 300071, China5Department of Pathophysiology, Nankai University School of Medicine, Tianjin 300071, China

WANG Bao-yu Tel: 022-27557477, E-mail:wbylwg@sina.com;

Objective To establish an improved three-dimension (3D) and serum-free approach to differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into endothelial cells, and detect the endothelial functions of the obtained cells.MethodsWe cultured undifferentiated H9 human embryonic stem cell line in low-adhesion dishes to form embryonic bodies (EBs). After 12 days, EBs were harvested, re-suspended into rat tail collagen type I, and put into the incubator (37℃). After 30 minutes, EGM-2 culture medium was added to the solidified collagen, and the EBs were cultured for another 3 days to form embryonic body-sproutings (EB-sproutings). EB-sproutings were digested with 0.25% collagenase I and 0.56 U/ml Liberase Blendzyme for 20 minutes respectively, and the CD31+cells were sorted by FACS. The endothelial functions were tested by Dil-ac-LDL uptake assay and tube formation assay.ResultsThis approach raised the efficiency of endothelial differentiation to 18%, and also avoided the contamination with animal materials. The obtained hESC-derived endothelial cells (hESC-ECs) had the similar pattern of surface biomarkers as human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), and their endothelial functions were confirmed by the uptake of Dil-ac-LDL and the tube formation on Matrigel.ConclusionsThe improved 3D approach can enhance the efficiency of differentiation from hESCs into endothelial cells. Furthermore, serum free differentiation system may be applied in future hESC-based therapies for various ischemic diseases.

human embryonic stem cells; human embryonic stem cell-derived endothelial cells; three dimension differentiation; CD31

王寶玉 電話：022-27557477，電子郵件：wbylwg@sina.com；李宗金 電話：022-23509475，電子郵件：zongjinli@nankai.edu.cn

R322.1

A

1000-503X(2012)06-0539-06

國(guó)家自然科學(xué)基金 (31071308)和天津應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(12JCZDJC24900)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(31071308) and Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology (12JCZDJC24900)

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.06.001

LI Zong-jin Tel:022-23509475, E-mail: zongjinli@nankai.edu.cn

2012-01-13)