諾西肽產(chǎn)生菌的菌種選育

劉 平

（丹東市食品藥品檢驗所，遼寧 丹東 118002）

諾西肽（Nosihepide）是由活躍鏈霉菌（Streptomyces actuosu）產(chǎn)生的一種含硫多肽類抗生素，分子式為C15H43N13O12S6，屬硫鏈絲菌素（thiostrepton）類[1]。它在體內(nèi)能有效抑制革蘭氏陽性細菌的活性[2]。諾西肽目前主要作為飼料添加劑，優(yōu)點是不被畜禽吸收、在體內(nèi)無殘留，微量加入飼料中就可以提高禽畜的出肉率[2]，并可加入魚餌中以防止魚類的壞死性腸炎及加快其生長。國外于20世紀(jì)80年代末批準(zhǔn)上市，目前日本和法國已將其列為法定飼料添加劑。

1 實驗材料

1.1 菌種

出發(fā)菌：諾西肽產(chǎn)生菌S.actuosus（由沈陽藥大實驗室提供）；鑒定菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）

1.2 藥品

亞硝基胍；95%乙醇；糊精；酵母粉；NaCl；CaCO3等

1.3 儀器

搖床（250r/min）；高壓滅菌鍋；超凈工作臺；電子天平；恒溫水??；紫外燈箱（紫外燈15W，照射距離40cm）；離心機。

1.4 試劑

1.4.1 亞硝基胍溶液（NTG）

電子天平精確稱取NTG于無菌試管中，加入微量N，N—二甲基甲酰胺（DMF）溶解，用適量磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.4.2 展開劑

氯仿：甲醇：醋酸 = 86：12：2（體積比）

2 實驗方法

2.1 紫外線誘變

取2ml單孢子懸液于培養(yǎng)皿中，置于紫外燈箱中，在輕微震蕩下照射不同時間，立即避光培養(yǎng)1h，經(jīng)稀釋后涂布培養(yǎng)。

2.2 NTG誘變

取單孢子懸液于無菌試管中，加入NTG溶液28℃或40℃水浴，經(jīng)稀釋后涂布培養(yǎng)。

2.3 效價測定

取發(fā)酵液以1∶1（V/V）比例加入95%乙醇，37℃浸泡半小時，離心取上清液用生物效價法測定。

圖1 死亡率曲線

圖2 正變率曲線

圖3 死亡率曲線

圖4 正變率曲線

3 結(jié)果與討論

3.1 出發(fā)菌株的篩選及穩(wěn)定性考察

對原始菌株S.actuosus進行自然分離，選擇在連續(xù)傳代下仍有較好產(chǎn)抗能力的S-19作為誘變出發(fā)菌株。

3.2 紫外線誘變

依實驗方法2.1對菌濃為107個/mL的S-19孢子懸液進行不同劑量的紫外線照射處理，以未處理菌液作對照，稀釋涂平皿，生長7天后將對照組與處理組的菌落數(shù)進行比較可得死亡率如圖1所示，不同劑量下的正變率如圖2。

由圖1可知紫外線照射120s死亡率為99.7%，用較大的作用劑量作用該菌仍有存活，可見此菌對紫外線不十分敏感。由圖2可知，在劑量為60秒時正變率最大為19.3%，劑量小于或大于60s正變率均明顯降低。由上得出：紫外線對該菌的誘變最佳劑量為60s。

3.3 NTG誘變

3.3.1 NTG誘變作用濃度的選擇

依實驗方法2.2對菌濃107個/mL的S-19孢子懸液用不同濃度的NTG溶液水浴處理，以未處理菌液做對照，稀釋涂平皿，生長7d后將對照組與處理組的菌落數(shù)進行比較可得死亡率如圖3所示，不同作用濃度下的正變率如圖4。

由圖2可知當(dāng)NTG的作用濃度為3mg/mL時死亡率為99.99%趨近完全死亡，可見此菌對NTG作用較敏感。由圖3可知，在NTG濃度為時正變率最大為23.2%，濃度小于或大于1mg/mL正變率較低，尤其隨著濃度的加大正變率明顯降低。實驗中發(fā)現(xiàn)：濃度過大不僅死亡率很高、正變率降低、負變率明顯增加，而且菌落形態(tài)、產(chǎn)孢子情況、色素顏色、生長速度發(fā)生很大的變化。由上得出：此菌對NTG作用較敏感，較佳的作用濃度為1mg/mL。

3.3.2 NTG誘變的最佳作用條件的選擇

影響NTG誘變作用的因素不僅是NTG的作用濃度，還包括：NTG作用的pH、作用時間、作用溫度等。通過正交實驗可以確定最佳作用條件。正交實驗設(shè)計方案見表1，結(jié)果及分析見表2。

表1 The table of factor and lever

由表2最優(yōu)水平可知，最佳NTG誘變的條件為：在作用濃度為1mg/mL下，NTG溶液pH為6.0（A2）、28℃水?。˙1）、作用時間為1h（C1）。在此條件下進行NTG誘變可得到較高的正變率。另由表2中Rj值可知影響正變率的最顯著的因素為作用溫度（C），其次為作用時間（A），再者是pH值（B）。

3.4 出發(fā)菌株的誘變結(jié)果

由原始菌株S自然分離得到出發(fā)菌株S-19，S-19用紫外線和NTG依次進行誘變，其結(jié)果和誘變譜系見圖5。

由圖5可以看出：通過紫外線、NTG的誘變，自然分離等的手段，最終得到諾西肽產(chǎn)量較高的菌株9-3-17，其諾西肽的產(chǎn)量是出發(fā)菌株S的3倍。

表2 正交實驗及結(jié)果分析表

圖5 Genealogy of nosiheptide producing mutants* Relative Potency

4 結(jié) 論

獲得出發(fā)菌株S-19；紫外線對該菌的最佳誘變劑量為60s；NTG對該菌的誘變最佳條件是：作用濃度為1mg/mL，溶液pH為6.0，作用溫度為28℃，作用時間為1h；最終得到誘變菌株9-3-17，其諾西肽的產(chǎn)量是出發(fā)菌株的3倍。

[1]周珮.深層培養(yǎng)諾西肽的初步研究[J].中國抗生素雜志,1990,15(4):308-309.

[2]Claude,P.Identification of Nosiheptide in Feeds and Detection of Residues in Animal Tissue[J].J Asoc Off Anal Chem.,1979,62(5):976-981.