PPARγ激動(dòng)劑對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠p38MAPK活化的影響

李清華 徐萍 王靜 姜景平 陳令全

PPARγ激動(dòng)劑對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠p38MAPK活化的影響

李清華 徐萍 王靜 姜景平 陳令全

p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)在炎癥反應(yīng)中通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)起重要作用[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorsγ，PPARγ)激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠血清促炎細(xì)胞因子有抑制作用。本研究探討p38 MAPK在ANP發(fā)生、發(fā)展中的作用及吡格列酮對(duì)p38 MAPK的影響，進(jìn)一步了解PPARγ激動(dòng)劑的抗炎機(jī)制。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：54只雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重160～200 g，購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。按數(shù)字表法隨機(jī)分成對(duì)照組、ANP組及吡格列酮干預(yù)組(干預(yù)組)，每組18只。采用胰管逆行注射50 g/L牛磺膽酸鈉(Sigma公司)1 μl/g體重的方法制備ANP模型。對(duì)照組開(kāi)腹后只翻動(dòng)胰腺并以鈍器輕劃胰腺3次后關(guān)腹。干預(yù)組在術(shù)后立即腹腔內(nèi)注射10% DMSO-吡格列酮溶液50 mg/kg體重。術(shù)后3、6、12 h分批經(jīng)腹主動(dòng)脈放血處死大鼠, 觀察胰腺大體病理改變，并取胰頭部組織，部分用40 g/L中性甲醛固定，部分置液氮保存。

2．胰腺病理檢查：胰腺大體病理觀察采用Hughes等[2]標(biāo)準(zhǔn)，從水腫、出血、脂肪壞死3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分。福爾馬林固定標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野觀察胰腺組織病理學(xué)變化，并依據(jù)Schmidt等[3]標(biāo)準(zhǔn)從水腫、感染、出血和壞死4個(gè)方面評(píng)分。

3．磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)檢測(cè)：取凍存標(biāo)本100 mg，常規(guī)提取總蛋白，BCA蛋白濃度分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)p-p38MAPK。p-p38MAPK單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgM購(gòu)自Santa cruz公司。用Bandscan圖像分析系統(tǒng)掃描目的條帶積分灰度值表示其相對(duì)表達(dá)量。

4．生存率實(shí)驗(yàn)：16只雄性SD大鼠隨機(jī)分成ANP組和干預(yù)組，造模方法同上。干預(yù)組大鼠術(shù)后每12 h重復(fù)給予吡格列酮 50 mg/kg體重，ANP組給予10% DMSO，觀察兩組大鼠制模后60 h的生存率。

二、結(jié)果

1．胰腺病理改變：對(duì)照組大鼠胰腺眼觀呈淡粉紅色，薄片狀，顏色均勻一致，光澤度好；ANP組在注射后沿胰膽管周圍組織立即充血、水腫，并逐漸擴(kuò)展；干預(yù)組大鼠大體改變與ANP組相似，但病變程度較同時(shí)點(diǎn)ANP組輕。胰腺大體病理評(píng)分見(jiàn)表1。干預(yù)組6、12 h時(shí)的胰腺損傷較同時(shí)點(diǎn)ANP組顯著減輕(P值為0.02483、0.04126)。鏡下見(jiàn)對(duì)照組胰腺無(wú)明顯病理改變；ANP組胰腺明顯水腫，小葉間隔增大，間質(zhì)內(nèi)充斥大量淡紅色水腫液，部分腺泡呈孤島狀，并可見(jiàn)大片出血壞死，腺泡小葉結(jié)構(gòu)被破壞，松散、紊亂，胰腺實(shí)質(zhì)及間質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大量嗜中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；干預(yù)組鏡下表現(xiàn)與ANP組大體相似，但病變程度較輕(圖1)。胰腺病理組織學(xué)評(píng)分見(jiàn)表1。ANP組和干預(yù)組的胰腺病理評(píng)分均顯著高于對(duì)照組；但干預(yù)組12、24 h時(shí)的病理評(píng)分較同時(shí)點(diǎn)ANP組顯著降低(P=0.00328)。

表1 3組大鼠胰腺大體及組織學(xué)評(píng)分

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

圖1對(duì)照組(a)、ANP組(b)、干預(yù)組(c)大鼠6 h時(shí)的胰腺病理組織學(xué)變化(×200)

2．胰腺組織p-p38MAPK水平：對(duì)照組胰腺低表達(dá)p-p38MAPK；ANP組p-p38MAPK表達(dá)在造模后3 h即上升到峰值，12 h時(shí)的表達(dá)水平明顯下降，但仍然顯著高于對(duì)照組(P=0.02386)；干預(yù)組p-p38MAPK表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，但6 h時(shí)的表達(dá)顯著低于ANP組(P=0.04126，表2，圖2)。

表2 3組大鼠胰腺組織p-p38MAPK的表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

圖2 對(duì)照組、ANP組、干預(yù)組大鼠胰腺組織p-p38MAPK的表達(dá)

3．大鼠生存率：ANP組大鼠造模后12 h死亡3只，24、36、48 h各死亡1只，60 h的生存率為12.5%；干預(yù)組造模后24 h死亡1只，36、48 h各死亡2只，60 h生存率為37.5%，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.248)。

討論各種炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和損傷刺激都可造成p38MAPK信號(hào)系統(tǒng)的激活，從而調(diào)控下游基因包括TNF-α、IL-6等的表達(dá)，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)[4]。p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與維持細(xì)胞的基礎(chǔ)生理狀態(tài)，因此，正常胰腺腺泡細(xì)胞有其低表達(dá)[5]。Blinman等[6]研究顯示，p38MAPK在調(diào)節(jié)胰腺腺泡細(xì)胞的細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生的信號(hào)通路中占主導(dǎo)地位，在重癥急性胰腺炎發(fā)病早期及疾病進(jìn)展中起重要推動(dòng)作用。Ren等[7]報(bào)道，?；悄懰徕c誘導(dǎo)的ANP大鼠在造模后3 h p38MAPK活性迅速達(dá)到峰值，24 h時(shí)仍明顯高于基礎(chǔ)活性。本結(jié)果顯示，造模后3 h，磷酸化的p38MAPK表達(dá)即達(dá)到峰值，并維持在較高水平，12 h時(shí)仍高于對(duì)照組水平，提示在ANP發(fā)病早期p38MAPK即參與炎癥反應(yīng)。與Ren等的研究結(jié)果一致。

p38MAPK和NF-κB是調(diào)節(jié)胰腺腺泡細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子的兩條重要信號(hào)通路。Jiang等[8]及Ricote等[9]報(bào)道，PPARγ激動(dòng)劑能通過(guò)抑制NF-κB而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。我們的前期研究也證實(shí)了PPARγ激動(dòng)劑吡格咧酮可通過(guò)抑制NF-κB活化及抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)而減輕胰腺炎癥[10]。本結(jié)果顯示，給予吡格咧酮可明顯抑制p38MAPK的活化，減輕ANP大鼠的胰腺病理?yè)p傷，明顯提高ANP大鼠生存率，提示PPARγ激動(dòng)劑干預(yù)處理可能是早期控制SAP病情的有效手段。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.022

201600 上海，上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院松江分院消化內(nèi)科

徐萍，Email:yfyxp@yahoo.com.cn

2011-10-12)

(本文編輯：屠振興)