胰腺癌MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)特異性抗腫瘤的免疫反應(yīng)

陳江 郭曉鐘 李宏宇 邵曉東 劉旭 趙佳鈞 王迪

·論著·

胰腺癌MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)特異性抗腫瘤的免疫反應(yīng)

陳江 郭曉鐘 李宏宇 邵曉東 劉旭 趙佳鈞 王迪

目的研究人胰腺癌MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞(DC)誘導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，為DC疫苗治療胰腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法從外周血中分離單核細(xì)胞(PBMC)并培養(yǎng)成DC，從細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志進(jìn)行鑒定。通過RT-PCR擴(kuò)增胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞的MUC1 mRNA后用電穿孔法將其轉(zhuǎn)染DC。采用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)DC的MUC1的表達(dá)。用四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測DC存活率。采用51Cr標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染MUC1 mRNA的DC誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)；應(yīng)用ELASA法檢測CTL的IFN-γ釋放量。結(jié)果培養(yǎng)獲得的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的DC形態(tài)特征和表面標(biāo)志(CD40+、HLA-DR+、CD83+、CD86+)。MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染 DC 48 h后，細(xì)胞MUC1 mRNA表達(dá)水平最高，為38.43(36.89～48.06)，蛋白表達(dá)亦最強(qiáng)。轉(zhuǎn)染后DC的存活率穩(wěn)定在80%左右。轉(zhuǎn)染MUC1 mRNA的 DC可有效誘導(dǎo)HLA-A2+/MUC+特異性CTL免疫反應(yīng)；胰腺癌Capan-2細(xì)胞與轉(zhuǎn)染MUC1的DC刺激MUC1特異性CTL的24 h IFN-γ釋放量分別為(28.44±4.96)和(16.31±2.54)U/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論人胰腺癌MUC1 mRNA體外轉(zhuǎn)染DC后可誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。

樹突細(xì)胞； RNA，信使； 轉(zhuǎn)染； 胰腺腫瘤； T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞毒性

樹突細(xì)胞(dendritic cells, DCs)腫瘤疫苗作為一種主動免疫的抗腫瘤方法，其臨床應(yīng)用已引起了學(xué)界的高度重視[1]。MUC1是一種高糖基化蛋白，具有高度的抗原性，并能夠被細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)所識別，因此被認(rèn)為是腫瘤生物治療的理想的靶點(diǎn)[2]。超過90%的胰腺癌存在MUC1的高表達(dá)，故本研究將人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染患者DC，觀察轉(zhuǎn)染后DC誘導(dǎo)的MUC1特異性CTL對靶細(xì)胞的殺傷作用，為臨床構(gòu)建胰腺癌相關(guān)抗原MUC1 DC腫瘤疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

一、DC的分離、培養(yǎng)和鑒定

收集20例健康志愿者和8例胰腺癌患者(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院供血科、消化科提供)外周血，采用Ficoll-plus paque T密度梯度離心法分離單核細(xì)胞(PBMC)，常規(guī)培養(yǎng)。取未貼壁細(xì)胞另作培養(yǎng)備用；貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h，加入800 IU/ml重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和500 IU/ml重組人IL-4(美國PeproTec公司)培養(yǎng)5 d，加入10 ng/ml TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)2 d，收集成熟DC。分別使用倒置顯微鏡和電子顯微鏡觀察DC形態(tài)學(xué)特征。收集的DC分裝5管，分別加入鼠抗人熒光標(biāo)記的CD40、HLA-DR、CD83、CD86單抗和作為對照的IgG(美國Santa-Cruz公司)，用流式細(xì)胞儀分析鑒定。每個(gè)樣品分析細(xì)胞數(shù)>1×106個(gè)。

二、胰腺癌細(xì)胞MUC1 mRNA擴(kuò)增及DC轉(zhuǎn)染

人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2為沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室保存。常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，用Trizol抽提細(xì)胞總RNA。采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)MUC1及作為校正的看家基因次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)引物。MUC1引物上游5′-TGA GTG ATG TGC-3′，下游5′-CTG CCC GTA GTT CTT TCG-3′，產(chǎn)物158 bp；HPRT引物上游5′-GGT TCT CGG GGC ACC TCT-3′，下游5′-TCG GCT TGA AAT GAC CTA ATG-3′，產(chǎn)物221 bp。應(yīng)用Sensiscript RT Kit (Qiagen公司)逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板，應(yīng)用T7 mMessage mMachine試劑盒(Ambion公司)于37℃ 2～4 h體外轉(zhuǎn)錄為MUC1 mRNA，沉淀后保存。參考Milazzo等[3]方法，2 mm的電極杯內(nèi)加入200 μl DC懸液和20 μg MUC1 mRNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。電壓300 V、間隔125 ms、4個(gè)脈沖，持續(xù)250 ms。電穿孔后立刻置入4℃冰箱靜置10 min，移入加有完全培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)0、12、24、48、72、96 h。

三、DC的MUC1表達(dá)及存活率檢測

收集1×106個(gè)電轉(zhuǎn)染的DC，用Trizol提取總RNA，應(yīng)用QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒(Qiagen公司)行PCR。反應(yīng)條件：95℃ 15 min，94℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，最后68℃ 60 s中止反應(yīng)。用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以轉(zhuǎn)染后0 h的表達(dá)量為1進(jìn)行相對定量[4]。每個(gè)樣品重復(fù)2次，取均值。

將電轉(zhuǎn)染的DC懸于提取緩沖液 (100 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%去氧膽酸鈉，5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物，0.1 mmol/L胃酶抑素A，0.1 mmol/L抗痛素，0.1 mmol/L糜蛋白酶抑制素，0.2 mmol/L亮肽素，10 μg/ml抑酞酶，0.5 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑，1 mM 苯甲脒) 冰上反應(yīng)15 min，14 000 r/min離心20 min，取上清，應(yīng)用BCA法定量蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測MUC1蛋白表達(dá)。兔抗人MUC1多抗購自DPC-Biermann公司，ECL購自Amersham公司。同時(shí)應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(Sigma公司)法檢測DC存活率。

四、51Cr標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

按Heiser等[5]方法，從非貼壁的PBMC中獲得MUC1特異性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。分別以轉(zhuǎn)染MUC1 mRNA、PBMC總RNA、綠色熒光蛋白(GFP)RNA、MiaPaCa-2總RNA 24 h的DC以及Capan-2和MiaPaCa-2細(xì)胞作為靶細(xì)胞。將2×106個(gè)靶細(xì)胞與100 μ Ci NaCrO4(中國同位素公司)培養(yǎng)1 h，計(jì)數(shù)5×103個(gè)51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞與連續(xù)稀釋的效應(yīng)細(xì)胞以不同的效靶細(xì)胞比在96孔板中培養(yǎng)6 h。吸取50 μl上清液，使用伽馬射線測量計(jì)數(shù)器測量51Cr的每分鐘脈沖數(shù)(CPM)。計(jì)算特異性裂解液的裂解百分比，即[(實(shí)驗(yàn)CPM-自發(fā)CPM)/(最高CPM-自發(fā)CPM)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

五、γ-干擾素(IFN-γ)釋放實(shí)驗(yàn)

將上述靶細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，以自體MUC1特異性CTL細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞。按照CTL細(xì)胞與刺激細(xì)胞的設(shè)定比例，在96孔板中常規(guī)培養(yǎng)24 h，總體積200 μl。取培養(yǎng)上清，采用ELASA試劑盒(Genzyme公司)檢測IFN-γ分泌量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果以105反應(yīng)細(xì)胞24 h的IFN-γ釋放量表示(U/ml)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、DC的形態(tài)及表型

PBMC經(jīng)體外分離、培養(yǎng)，數(shù)量達(dá)初始數(shù)量的10倍左右。多數(shù)細(xì)胞組合成黏附力松散的細(xì)胞克隆，呈懸浮或團(tuán)塊生長，胞體向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起，呈現(xiàn)DCs特殊的形態(tài)特征(圖1)。細(xì)胞具有典型的成熟DC表面標(biāo)志：CD40+、HLA-DR+、 CD83+和CD86+(圖2)。

圖1DC的光鏡(a)、掃描(b)及透射(c)電鏡下的形態(tài)(×200，刻度線為1 μm)

圖2 DC的表面標(biāo)志

二、MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染后DC的MUC1表達(dá)

MUC1 mRNA電轉(zhuǎn)染DC 0、12、24、48、72、96 h的MUC1mRNA表達(dá)量分別為1、14.87(12.49～17.35)、24.11(21.82～27.30)、38.43(36.89～48.06)、17.39(13.02～19.13)、5.92(3.91～7.87)，以轉(zhuǎn)染后48 h的表達(dá)水平最強(qiáng)(圖3)。MUC1蛋白表達(dá)亦在48 h最強(qiáng)，而后漸減弱(圖4)。

圖3 轉(zhuǎn)染后DC的MUC1 mRNA表達(dá)

圖4 轉(zhuǎn)染后DC的MUC1蛋白表達(dá)

三、MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染后DC的存活率

MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染后DC的存活率在不同時(shí)間點(diǎn)相差不大，穩(wěn)定在80%左右(圖5)。

圖5 MUC1 mRNA 轉(zhuǎn)染后DC的存活率

四、自體MUC1特異性CTL對DC及胰腺癌MiaPaCa-2、Capan-2細(xì)胞的殺傷力

無論是健康志愿者還是胰腺癌患者，轉(zhuǎn)染MUC1 mRNA的DC均能誘導(dǎo)自體MUC1特異性CTL的免疫反應(yīng)，能有效識別和殺傷轉(zhuǎn)染MUC1 mRNA的DC，而轉(zhuǎn)染GFP mRNA、PBMC總RNA的DC無識別和殺傷作用，并且轉(zhuǎn)染MUC1 mRNA的DC誘導(dǎo)的CTL在識別和殺傷特異性靶細(xì)胞的能力和強(qiáng)度上優(yōu)于轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2總RNA的DC(圖6)。

圖6 MUC1特異性CTL對DC的殺傷力

但來自人類HLA-A2+胰腺癌患者的MUC1特異性CTL能有效識別和殺傷HLA-A2+/MUC1+的Capan-2胰腺癌細(xì)胞，而不能識別和殺傷HLA-A2-/MUC1+的MiaPaCa-2胰腺癌細(xì)胞，亦不能識別和殺傷HLA-A2+/MUC1-的靶細(xì)胞(轉(zhuǎn)染PBMC或GFP RNA的DC，圖7)。

圖7MUC1特異性CTL對不同HLA-A2和MUC1表達(dá)靶細(xì)胞的殺傷力

五、DC刺激抗原特異性CTL的IFN-γ釋放

轉(zhuǎn)染PBMC或GFP RNA的DC及HLA-A2-/MUC1+的MiaPaCa-2不能刺激抗原特異性CTL分泌IFN-γ；而HLA-A2+/MUC1+的Capan-2細(xì)胞及轉(zhuǎn)染MUC1 mRNA的DC能顯著激活、誘導(dǎo)MUC1特異性CTL分泌IFN-γ。Capan-2刺激CTL的24 h IFN-γ釋放量達(dá)(28.44±4.96) U/ml，遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)染MUC1的DC的(16.31±2.54)U/ml(P<0.05，圖8)。

圖8 不同效應(yīng)細(xì)胞刺激MUC1特異性CTL的IFN-γ釋放

討 論

DC腫瘤疫苗的實(shí)質(zhì)是以CTL為基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫，疫苗構(gòu)建的關(guān)鍵因素在于選取適合的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。盡管已證實(shí)惡性細(xì)胞高表達(dá)TAA，但其中少有易受T細(xì)胞影響的靶點(diǎn)[6]。MUC1是高糖基化I型糖蛋白的一種，其蛋白分子可通過特定的跨膜結(jié)構(gòu)“錨泊”在細(xì)胞表面，主要組分是由約20個(gè)氨基酸構(gòu)成的不定數(shù)串列重復(fù)區(qū)構(gòu)成的獨(dú)立的胞外域。該蛋白結(jié)構(gòu)簡單清晰，易被免疫細(xì)胞所呈遞和識別[7]。同時(shí)，MUC1的表達(dá)具有高度的腫瘤特異性，在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)率可達(dá)90%以上[2]，因此被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

本研究顯示，來自健康志愿者和胰腺癌患者的DC轉(zhuǎn)染MUC1 mRNA后誘導(dǎo)的CTL免疫反應(yīng)強(qiáng)度近乎相同。原因可能是引入的抗原負(fù)荷量不足。

MUC1特異性CTL只能識別和殺傷HLA-A2+/MUC1+的靶細(xì)胞。而對HLA-A2-/MUC1+的MiaPaCa-2細(xì)胞以及HLA-A2-/MUC1-的轉(zhuǎn)染有自體(PBMC)或無關(guān)組織(GFP)RNA的DC未引出特異性免疫殺傷效應(yīng)。提示MUC1特異性CTL免疫反應(yīng)受到MHC I類抗原呈遞的限制。

總之，本研究將擴(kuò)增的MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染DC，在體外成功誘導(dǎo)出了針對胰腺癌細(xì)胞的MUC1特異性CTL免疫反應(yīng)，為MUC1 DC疫苗的構(gòu)建與應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Inductionofspecificanti-tumorimmuneresponsesagainstpancreaticcancerbytransfecteddendriticcellswithpancreaticcancerMUC1mRNA

CHENJiang,GUOXiao-zhong,LIHong-yu,SHAOXiao-dong,LIUXu,ZHAOJia-jun,WANGDi.

DepartmentofGastroenterological,ShenyangGeneralHospitalofPLA,Shenyang110840,China

GUOXiao-zhong,Email:Guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the induction of specific anti-tumor immune response by transfected dendritic cells (DCs) with MUC1 mRNA of human pancreatic cancer, and to provide the experimental evidences for the treatment of human pancreatic cancer with DC vaccine.MethodsDCs were isolated and cultured from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and then were identified by cell morphology and surface markers. After being transcripted and amplified, MUC1 mRNA was transfected into DCs by electroporation. The expression of MUC1 in DCs at different time points was detected by quantitative real-time PCR and Western blot. The survival rate of DCs before and after transfection was determined by MTT method. The induction of specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) response by MUC1 mRNA transfected DCs was measured by51Cr standard cytotoxicity test. The released amount of IFN-γ was evaluated by ELISA method.ResultsThe cultured cells appeared typical characteristics with regard to morphology and phenotype (CD40+, HLA-DR+, CD83+, CD86+). After MUC1 mRNA transfection for 48 h, the expression of MUC1 mRNA of DCs reached the highest point (38.43) and the MUC1 protein expression also reached the highest point at 72 h. The survival rate of DCs was stabilized around 80% after transfection. The DCs transfected with MUC1 mRNA could effectively induce HLA-A2+/MUC1+specific CTL immune responses. Stimulated by pancreatic cancer cell line Capan-2 cells or the DCs transfected with MUC1 mRNA, the IFN-γ released in 24 h by MUC1 specific CTL were (28.44±4.96)U/ml and (16.31±2.54)U/ml, respectively. The difference between the two groups was statistically significant (P<0.05).ConclusionsDCs transfected with human pancreatic cancer MUC1 mRNA could induce CTLs and produce specific anti-tumor immunity.

Dendritic cells; RNA, messenger; Transfection; Pancreatic neoplasms; T-lymphocytes, cytotoxic

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.004

國家自然科學(xué)基金(81071982)

110016 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科

郭曉鐘，Email:guoxiaozhong1962@163.com

2012-02-02)

(本文編輯：屠振興)