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    重復(fù)高壓氧預(yù)處理對大鼠脊髓缺血再灌注損傷時糖調(diào)節(jié)蛋白78表達(dá)的影響

    2012-11-06 08:52:56邵忠華翟昌林
    醫(yī)學(xué)研究雜志 2012年7期
    關(guān)鍵詞:運(yùn)動神經(jīng)元后肢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

    邵忠華 翟昌林

    重復(fù)高壓氧預(yù)處理可減輕脊髓缺血再灌注損傷,主要機(jī)制可能與提高抗氧化酶活性有關(guān)[1]。糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)作為Hsp70家族成員之一,能夠抑制細(xì)胞毒性對抗細(xì)胞凋亡,是維持胚胎細(xì)胞生長和潛能細(xì)胞存活的必備物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。有研究表明GRP78在多種組織缺血再灌注損傷中表達(dá)上調(diào),能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化活性,對細(xì)胞的存活具有重要的保護(hù)作用[3]。高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)的脊髓缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制是否也涉及到GRP78并不清楚。本研究旨在探討重復(fù)高壓氧預(yù)處理對大鼠脊髓缺血再灌注損傷保護(hù)中GRP78表達(dá)的影響,以闡明其減輕脊髓缺血再灌注損傷的機(jī)制。

    材料與方法

    1.動物選擇及分組:清潔級雄性SD大鼠36只,3個月齡,體重250~300g,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所提供,采用隨機(jī)數(shù)字表法,將其隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(S組)、脊髓缺血再灌注組(I/R組)和重復(fù)高壓氧預(yù)處理氧(HOP)組。

    2.重復(fù)高壓氧艙處理:高壓氧艙(CE-10009,meiling chemical equipment,China)底置新鮮鈉石灰,將動物置入高壓氧艙后,先通入純氧10min,使高壓氧艙內(nèi)氧濃度>98%,然后勻速加壓至2.5 atmosphere absolute(ATA),加壓時間為20min,壓力至2.5 ATA時維持60min,然后以20min勻速減至常壓,1次/天,持續(xù)5天。I/R及S組動物亦置于艙內(nèi),模擬除壓力,氧濃度以外的其他過程和環(huán)境條件。最后一次處理后24h,制備脊髓缺血再灌注模型。

    3.脊髓缺血再灌注模型的制備:腹腔注射戊巴比妥鈉35mg/kg麻醉下,采用Zivin法復(fù)制模型,鼠俯臥位置于實(shí)驗(yàn)臺上,背部剪毛,取背部正中切口,切除L2~4雙側(cè)椎板,充分顯露L3,4節(jié)段硬脊膜[4]。然后仰臥位于實(shí)驗(yàn)臺上,腹部剪毛,取腹正中切口。分離腹主動脈至腎動脈水平,在左腎動脈起始部遠(yuǎn)端用Scoville-Lewis動脈夾夾閉腹主動脈進(jìn)行缺血,鉗夾點(diǎn)遠(yuǎn)端動脈搏動消失表示缺血成功,暫時關(guān)閉腹腔至動物蘇醒,缺血20min時進(jìn)行再灌注,鉗夾點(diǎn)遠(yuǎn)端動脈搏動恢復(fù)表示再灌注成功,動脈搏動恢復(fù)表示再灌注成功。維持室溫22℃,通風(fēng)良好。其中I/R組有1只大鼠死亡,HOP組有2只大鼠死亡。

    4.后肢運(yùn)動功能評價:再灌注1h后于24、48、72h分別評價后肢運(yùn)動功能,采用Basso等[5]介紹的神經(jīng)功能評定法―BBB評分法,將后肢運(yùn)動分為22個等級,后肢完全癱瘓為0分,完全正常為21分,兩者之間根據(jù)功能分別定為1~20分,其基本內(nèi)容為:關(guān)節(jié)活動的數(shù)目和范圍,負(fù)重程度及前后肢協(xié)調(diào)性,前、后爪和尾部的活動情況,評分時間4min。

    5.標(biāo)本制備:進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分后,立即處死動物,取L5~8脊髓節(jié)段,部分以10%甲醛溶液固定,石蠟包埋切片,用于病理學(xué)結(jié)果的觀察。部分凍存于液氮組織,作熒光定量PCR和WB檢測用。

    6.熒光定量PCR檢測GRP78 mRNA表達(dá):用Trizol試劑提取脊髓組織總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作合成cDNA,所用引物由賽百盛生物工程公司合成。GRP78引物序列如下:上游5'-TGGTCAATGACGCCGAGAA-3',下游5'-AGGGCCTCCACTTCCATAGAG-3';內(nèi)參基因?yàn)镚APDH,上游:5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3',下游:5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3';在eppendoff熒光定量PCR儀器上按照試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)條件:96孔板,1500g,離心2 min。進(jìn)行實(shí)時定量PCR,設(shè)置反應(yīng)條件如下:預(yù)變性:95℃,5mins,變性:95℃,30s,退火 58℃:30s,延伸 72℃:60s,共計(jì)35個循環(huán)。stage one 1個循環(huán):預(yù)變性,50℃,2min→stage two 1個循環(huán):變性,95℃,10 min→stage three 40個循環(huán):變性,95℃,15s→延伸,60℃,1min;stage one 1 個循環(huán):50℃,2min→stage two 1個循環(huán):95℃,10min→stage three 40個循環(huán):95℃,15s→60℃,1min;熔解曲線檢測設(shè)置程序如下:95℃,15 s→60℃,1min→95℃,15s;收集數(shù)據(jù):采用ΔΔCT值比較法進(jìn)行相對定量,ΔΔCt=[Ct GI(待測樣品)-Ct GAPDH(待測樣品)]-[Ct GI(標(biāo)準(zhǔn)樣品)-Ct GAPDH(標(biāo)準(zhǔn)樣品)],平均相對含量 =2-averag△△CT×100%。

    7.GRP78蛋白表達(dá)水平的測定:采用Western blotting進(jìn)行測定,取脊髓組織,勻漿后提取蛋白,定量后取總蛋白40μg,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉,加GRP78兔多克隆抗體(稀釋度1∶500,Santa Cruz公司,美國)辣根過氧化酶標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司,中國,)化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng),X線片曝光顯影,經(jīng)ABB成像分析系統(tǒng)掃描(ABI公司,美國),以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值反映GRP78的表達(dá)水平。

    8.病理學(xué)結(jié)果的觀察:取石蠟包埋的脊髓組織,冠狀切片,片厚6μm,HE染色古薄今。XSP30型光學(xué)顯微鏡下(×400,重慶光電儀器有限公司)觀察,并對脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù),正常神經(jīng)元表現(xiàn)為多角形結(jié)構(gòu),胞核結(jié)構(gòu)清晰,胞質(zhì)中尼氏體存在。每個標(biāo)本取3張切片,每張切片隨機(jī)選取10個視野,取3張切片的平均值。

    9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1.3組大鼠后肢運(yùn)動功能評分及脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù):與S組比較,I/R組和HOP組后肢運(yùn)動功能和脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)降低(P<0.05);與I/R組比較,HOP組后肢運(yùn)動功能和脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)升高(P<0.05)(表 1)。

    表1 3組大鼠后肢運(yùn)動功能評分及脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)的比較±s)

    表1 3組大鼠后肢運(yùn)動功能評分及脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)的比較±s)

    與 S組比較,*P <0.05;與 I/R 組比較,#P <0.05

    組別 n 后肢運(yùn)動功能評分 正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)16 19.2 ±2.9 19.5 ±3.2 19.9 ±3.6 17 ±4 I/R 組 15 5.4 ±1.6* 5.6 ±1.8* 5.7 ±1.7* 6 ±2*HOP 組 14 10.2 ±2.5*#10.3 ±2.3*#10.3 ±2.1*# 11 ±3*#72h S組24h 48h 72h

    2.3組大鼠脊髓組織GRP78 mRNA及其蛋白的表達(dá):與S組比較,I/R組與HOP組GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05);與I/R組比較,HOP組GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)(表2)。

    表2 3組大鼠脊髓組織GRP78 m RNA及其蛋白表達(dá)的比較(±s)

    表2 3組大鼠脊髓組織GRP78 m RNA及其蛋白表達(dá)的比較(±s)

    與 S組比較,*P <0.05;與 I/R 組比較,#P <0.05

    組別 n GRP78 mRNA GRP78 16 0.29 ±0.07 0.31 ±0.10 I/R 組 15 0.57 ±0.12* 0.48 ±0.12*HOP 組 14 0.89 ±0.28*# 0.91 ±0.16蛋白S組#

    3.動物脊髓組織運(yùn)動神經(jīng)元HE染色結(jié)果:3組大鼠脊髓組織的病理學(xué)結(jié)果;S組脊髓組織結(jié)構(gòu)完好,神經(jīng)細(xì)胞形狀清楚,極性存在,核圓,輪廓光滑,核仁清晰可見,白質(zhì)排列規(guī)則。I/R組神經(jīng)細(xì)胞腫脹嚴(yán)重,極性變鈍,胞核顏色變淡,消散,部分神經(jīng)細(xì)胞壞死后留下死腔,白質(zhì)腫脹,且排列不規(guī)則。HOP組部分神經(jīng)細(xì)胞輕度腫脹,極性稍變鈍,核偏位,核仁輕度萎縮,少有胞核顏色變淡,消散,白質(zhì)稍腫脹,排列不規(guī)則,見圖1。

    討 論

    本研究采用了經(jīng)典的阻斷腎下腹主動脈的方法制備脊髓缺血再灌注模型,病理HE染色結(jié)果顯示了典型的脊髓病理學(xué)結(jié)構(gòu)改變以及運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)目的減少,與S組比較,I/R組神經(jīng)功能評分降低,提示脊髓缺血再灌注損傷模型制備成功。采用的重復(fù)高壓氧預(yù)處理方法增加了大鼠正常運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)目,改善后肢的運(yùn)動功能,顯示高壓氧預(yù)處理對大鼠脊髓缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

    圖1 各組動物脊髓組織運(yùn)動神經(jīng)HE染色圖(×200)

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78(endop lasmic reticulum molecular chaperon,GRP78),又稱為B ip,其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)節(jié)劑。現(xiàn)已證實(shí),GRP78在蛋白質(zhì)的正確折疊、鈣離子的平衡、減輕過氧化損傷、改善缺血微環(huán)境等方面扮演了多種重要角色。本研究結(jié)果提示,脊髓缺血再灌注時與S組比較,I/R組GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05),其原因可能與脊髓缺血再灌注期間微循環(huán)障礙,自由基蓄積和鈣失衡等各種刺激上調(diào)了GRP78表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活未折疊蛋白反應(yīng),使蛋白折疊能力提高、蛋白合成抑制以適應(yīng)應(yīng)激,但是長時間過強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則啟動細(xì)胞凋亡,這與本結(jié)果發(fā)現(xiàn)的正常運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目減少相一致[6,7]。

    本研究發(fā)現(xiàn)高壓氧預(yù)處理能夠進(jìn)一步上調(diào)GRP78的表達(dá)水平,較S組與I/P組均升高,這提示高壓氧預(yù)處理可能啟動了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)條件下,細(xì)胞可產(chǎn)生很多未折疊蛋白,未折疊蛋白反應(yīng)可使GRP78大量表達(dá),并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合,恢復(fù)蛋白質(zhì)正確構(gòu)象,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,因此,GRP78在應(yīng)激條件下對細(xì)胞起保護(hù)作用。這一結(jié)果與宋小燕等[8]的大鼠腦缺血再灌注早期GRP78和GADD153表達(dá)增高的結(jié)果是一致的。大鼠脊髓組織HE染色發(fā)現(xiàn),I/R組神經(jīng)細(xì)胞腫脹嚴(yán)重,極性變鈍,胞核顏色變淡,消散,部分神經(jīng)細(xì)胞壞死后留下死腔,白質(zhì)腫脹,且排列不規(guī)則。HOP組部分神經(jīng)細(xì)胞輕度腫脹,極性稍變鈍,核偏位,核仁輕度萎縮,少有胞核顏色變淡,消散,進(jìn)一步證實(shí)了重復(fù)高壓氧可以減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷,這可能與增加GRP78的表達(dá)有關(guān)。

    綜上所述,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重復(fù)高壓氧預(yù)處理可上調(diào)GRP78表達(dá),從而減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷,其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。臨床上以GRP78為靶點(diǎn),通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)對脊髓缺血再灌注損傷的治療具有重要意義。

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    2 Luo S,Mao C,Lee B,etal.GRP78/BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development[J].Mol Cell Biol,2006,26(15):5688-5697

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    8 宋小燕,趙永波.大鼠腦缺血再灌注后GRP78和GADD153的表達(dá)變化研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)病雜志,2008,25(2):139 -141

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