重復(fù)高壓氧預(yù)處理對大鼠脊髓缺血再灌注損傷時糖調(diào)節(jié)蛋白78表達(dá)的影響

邵忠華 翟昌林

重復(fù)高壓氧預(yù)處理可減輕脊髓缺血再灌注損傷，主要機(jī)制可能與提高抗氧化酶活性有關(guān)［1］。糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose－regulated protein 78，GRP78)作為Hsp70家族成員之一，能夠抑制細(xì)胞毒性對抗細(xì)胞凋亡，是維持胚胎細(xì)胞生長和潛能細(xì)胞存活的必備物質(zhì)基礎(chǔ)［2］。有研究表明GRP78在多種組織缺血再灌注損傷中表達(dá)上調(diào)，能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化活性，對細(xì)胞的存活具有重要的保護(hù)作用［3］。高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)的脊髓缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制是否也涉及到GRP78并不清楚。本研究旨在探討重復(fù)高壓氧預(yù)處理對大鼠脊髓缺血再灌注損傷保護(hù)中GRP78表達(dá)的影響，以闡明其減輕脊髓缺血再灌注損傷的機(jī)制。

材料與方法

1．動物選擇及分組:清潔級雄性SD大鼠36只，3個月齡，體重250～300g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(S組)、脊髓缺血再灌注組(I/R組)和重復(fù)高壓氧預(yù)處理氧(HOP)組。

2．重復(fù)高壓氧艙處理:高壓氧艙(CE－10009，meiling chemical equipment，China)底置新鮮鈉石灰，將動物置入高壓氧艙后，先通入純氧10min，使高壓氧艙內(nèi)氧濃度＞98%，然后勻速加壓至2．5 atmosphere absolute(ATA)，加壓時間為20min，壓力至2．5 ATA時維持60min，然后以20min勻速減至常壓，1次/天，持續(xù)5天。I/R及S組動物亦置于艙內(nèi)，模擬除壓力，氧濃度以外的其他過程和環(huán)境條件。最后一次處理后24h，制備脊髓缺血再灌注模型。

3．脊髓缺血再灌注模型的制備:腹腔注射戊巴比妥鈉35mg/kg麻醉下，采用Zivin法復(fù)制模型，鼠俯臥位置于實(shí)驗(yàn)臺上，背部剪毛，取背部正中切口，切除L2～4雙側(cè)椎板，充分顯露L3，4節(jié)段硬脊膜［4］。然后仰臥位于實(shí)驗(yàn)臺上，腹部剪毛，取腹正中切口。分離腹主動脈至腎動脈水平，在左腎動脈起始部遠(yuǎn)端用Scoville－Lewis動脈夾夾閉腹主動脈進(jìn)行缺血，鉗夾點(diǎn)遠(yuǎn)端動脈搏動消失表示缺血成功，暫時關(guān)閉腹腔至動物蘇醒，缺血20min時進(jìn)行再灌注，鉗夾點(diǎn)遠(yuǎn)端動脈搏動恢復(fù)表示再灌注成功，動脈搏動恢復(fù)表示再灌注成功。維持室溫22℃，通風(fēng)良好。其中I/R組有1只大鼠死亡，HOP組有2只大鼠死亡。

4．后肢運(yùn)動功能評價:再灌注1h后于24、48、72h分別評價后肢運(yùn)動功能，采用Basso等［5］介紹的神經(jīng)功能評定法―BBB評分法，將后肢運(yùn)動分為22個等級，后肢完全癱瘓為0分，完全正常為21分，兩者之間根據(jù)功能分別定為1～20分，其基本內(nèi)容為:關(guān)節(jié)活動的數(shù)目和范圍，負(fù)重程度及前后肢協(xié)調(diào)性，前、后爪和尾部的活動情況，評分時間4min。

5．標(biāo)本制備:進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分后，立即處死動物，取L5～8脊髓節(jié)段，部分以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，用于病理學(xué)結(jié)果的觀察。部分凍存于液氮組織，作熒光定量PCR和WB檢測用。

6．熒光定量PCR檢測GRP78 mRNA表達(dá):用Trizol試劑提取脊髓組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作合成cDNA，所用引物由賽百盛生物工程公司合成。GRP78引物序列如下:上游5'－TGGTCAATGACGCCGAGAA－3'，下游5'－AGGGCCTCCACTTCCATAGAG－3';內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，上游:5'－TGTTGCCATCAATGACCCCTT－3'，下游:5'－CTCCACGACGTACTCAGCG－3';在eppendoff熒光定量PCR儀器上按照試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)條件:96孔板，1500g，離心2 min。進(jìn)行實(shí)時定量PCR，設(shè)置反應(yīng)條件如下:預(yù)變性:95℃，5mins，變性:95℃，30s，退火 58℃:30s，延伸 72℃:60s，共計(jì)35個循環(huán)。stage one 1個循環(huán):預(yù)變性，50℃，2min→stage two 1個循環(huán):變性，95℃，10 min→stage three 40個循環(huán):變性，95℃，15s→延伸，60℃，1min;stage one 1 個循環(huán):50℃，2min→stage two 1個循環(huán):95℃，10min→stage three 40個循環(huán):95℃，15s→60℃，1min;熔解曲線檢測設(shè)置程序如下:95℃，15 s→60℃，1min→95℃，15s;收集數(shù)據(jù):采用ΔΔCT值比較法進(jìn)行相對定量，ΔΔCt=［Ct GI(待測樣品)－Ct GAPDH(待測樣品)］－［Ct GI(標(biāo)準(zhǔn)樣品)－Ct GAPDH(標(biāo)準(zhǔn)樣品)］，平均相對含量 =2－averag△△CT×100%。

7．GRP78蛋白表達(dá)水平的測定:采用Western blotting進(jìn)行測定，取脊髓組織，勻漿后提取蛋白，定量后取總蛋白40μg，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，加GRP78兔多克隆抗體(稀釋度1∶500，Santa Cruz公司，美國)辣根過氧化酶標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司，中國，)化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)，X線片曝光顯影，經(jīng)ABB成像分析系統(tǒng)掃描(ABI公司，美國)，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β－actin灰度值的比值反映GRP78的表達(dá)水平。

8．病理學(xué)結(jié)果的觀察:取石蠟包埋的脊髓組織，冠狀切片，片厚6μm，HE染色古薄今。XSP30型光學(xué)顯微鏡下(×400，重慶光電儀器有限公司)觀察，并對脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)，正常神經(jīng)元表現(xiàn)為多角形結(jié)構(gòu)，胞核結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)中尼氏體存在。每個標(biāo)本取3張切片，每張切片隨機(jī)選取10個視野，取3張切片的平均值。

9．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．3組大鼠后肢運(yùn)動功能評分及脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù):與S組比較，I/R組和HOP組后肢運(yùn)動功能和脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)降低(P＜0．05);與I/R組比較，HOP組后肢運(yùn)動功能和脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)升高(P＜0．05)(表 1)。

表1 3組大鼠后肢運(yùn)動功能評分及脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)的比較±s)

表1 3組大鼠后肢運(yùn)動功能評分及脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)的比較±s)

與 S組比較，*P ＜0．05;與 I/R 組比較，#P ＜0．05

組別 n 后肢運(yùn)動功能評分 正常運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)16 19．2 ±2．9 19．5 ±3．2 19．9 ±3．6 17 ±4 I/R 組 15 5．4 ±1．6* 5．6 ±1．8* 5．7 ±1．7* 6 ±2*HOP 組 14 10．2 ±2．5*#10．3 ±2．3*#10．3 ±2．1*# 11 ±3*#72h S組24h 48h 72h

2．3組大鼠脊髓組織GRP78 mRNA及其蛋白的表達(dá):與S組比較，I/R組與HOP組GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P＜0．05);與I/R組比較，HOP組GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)(表2)。

表2 3組大鼠脊髓組織GRP78 m RNA及其蛋白表達(dá)的比較(±s)

表2 3組大鼠脊髓組織GRP78 m RNA及其蛋白表達(dá)的比較(±s)

與 S組比較，*P ＜0．05;與 I/R 組比較，#P ＜0．05

組別 n GRP78 mRNA GRP78 16 0．29 ±0．07 0．31 ±0．10 I/R 組 15 0．57 ±0．12* 0．48 ±0．12*HOP 組 14 0．89 ±0．28*# 0．91 ±0．16蛋白S組#

3．動物脊髓組織運(yùn)動神經(jīng)元HE染色結(jié)果:3組大鼠脊髓組織的病理學(xué)結(jié)果;S組脊髓組織結(jié)構(gòu)完好，神經(jīng)細(xì)胞形狀清楚，極性存在，核圓，輪廓光滑，核仁清晰可見，白質(zhì)排列規(guī)則。I/R組神經(jīng)細(xì)胞腫脹嚴(yán)重，極性變鈍，胞核顏色變淡，消散，部分神經(jīng)細(xì)胞壞死后留下死腔，白質(zhì)腫脹，且排列不規(guī)則。HOP組部分神經(jīng)細(xì)胞輕度腫脹，極性稍變鈍，核偏位，核仁輕度萎縮，少有胞核顏色變淡，消散，白質(zhì)稍腫脹，排列不規(guī)則，見圖1。

討 論

本研究采用了經(jīng)典的阻斷腎下腹主動脈的方法制備脊髓缺血再灌注模型，病理HE染色結(jié)果顯示了典型的脊髓病理學(xué)結(jié)構(gòu)改變以及運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)目的減少，與S組比較，I/R組神經(jīng)功能評分降低，提示脊髓缺血再灌注損傷模型制備成功。采用的重復(fù)高壓氧預(yù)處理方法增加了大鼠正常運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)目，改善后肢的運(yùn)動功能，顯示高壓氧預(yù)處理對大鼠脊髓缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖1 各組動物脊髓組織運(yùn)動神經(jīng)HE染色圖(×200)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78(endop lasmic reticulum molecular chaperon，GRP78)，又稱為B ip，其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)節(jié)劑。現(xiàn)已證實(shí)，GRP78在蛋白質(zhì)的正確折疊、鈣離子的平衡、減輕過氧化損傷、改善缺血微環(huán)境等方面扮演了多種重要角色。本研究結(jié)果提示，脊髓缺血再灌注時與S組比較，I/R組GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P＜0．05)，其原因可能與脊髓缺血再灌注期間微循環(huán)障礙，自由基蓄積和鈣失衡等各種刺激上調(diào)了GRP78表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活未折疊蛋白反應(yīng)，使蛋白折疊能力提高、蛋白合成抑制以適應(yīng)應(yīng)激，但是長時間過強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則啟動細(xì)胞凋亡，這與本結(jié)果發(fā)現(xiàn)的正常運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目減少相一致［6，7］。

本研究發(fā)現(xiàn)高壓氧預(yù)處理能夠進(jìn)一步上調(diào)GRP78的表達(dá)水平，較S組與I/P組均升高，這提示高壓氧預(yù)處理可能啟動了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)條件下，細(xì)胞可產(chǎn)生很多未折疊蛋白，未折疊蛋白反應(yīng)可使GRP78大量表達(dá)，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合，恢復(fù)蛋白質(zhì)正確構(gòu)象，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，因此，GRP78在應(yīng)激條件下對細(xì)胞起保護(hù)作用。這一結(jié)果與宋小燕等［8］的大鼠腦缺血再灌注早期GRP78和GADD153表達(dá)增高的結(jié)果是一致的。大鼠脊髓組織HE染色發(fā)現(xiàn)，I/R組神經(jīng)細(xì)胞腫脹嚴(yán)重，極性變鈍，胞核顏色變淡，消散，部分神經(jīng)細(xì)胞壞死后留下死腔，白質(zhì)腫脹，且排列不規(guī)則。HOP組部分神經(jīng)細(xì)胞輕度腫脹，極性稍變鈍，核偏位，核仁輕度萎縮，少有胞核顏色變淡，消散，進(jìn)一步證實(shí)了重復(fù)高壓氧可以減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷，這可能與增加GRP78的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重復(fù)高壓氧預(yù)處理可上調(diào)GRP78表達(dá)，從而減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。臨床上以GRP78為靶點(diǎn)，通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)對脊髓缺血再灌注損傷的治療具有重要意義。

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