pH值對原代大鼠肝細(xì)胞凍存效果的影響

付建柱 張立軍 于則利

近30年的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明，對各種原因引起的急性肝功能衰竭和由于肝代謝酶缺陷引起的遺傳型代謝性疾病，肝細(xì)胞移植(hepatocytes transplantation，HT)是有效的治療手段之一［1］。肝細(xì)胞移植要求有高效率的肝細(xì)胞分離、保存方法［2］。但目前關(guān)于肝細(xì)胞分離和保存的技術(shù)操作仍有很多問題需要解決［3］。本實(shí)驗(yàn)針對pH值對大鼠肝細(xì)胞保存效果的影響進(jìn)行研究，以求能提高肝細(xì)胞保存效率。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)材料:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:純系雄性SD大鼠20只，鼠齡為3～4個(gè)月，體重為250～300g。(2)實(shí)驗(yàn)試劑:Belzer UW液為美國Bristol－Myers squibb公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州市四季青生物工程公司產(chǎn)品，臺(tái)盼藍(lán)和四唑鹽購自美國Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)液購自GIBCO公司，D－HANKS液為協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。(3)實(shí)驗(yàn)儀器:臺(tái)盼藍(lán)、四唑鹽、膠原酶Ⅳ等購于美國Sigma生物公司，戊巴比妥鈉為中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，D－Hank's液為中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，胎牛血清為杭州市四季青生物工程公司產(chǎn)品，RPMI－1640培養(yǎng)液為美國Gibco產(chǎn)品。二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO175)為日本SANYO公司產(chǎn)品，pH酸度計(jì)為德國Inolab公司產(chǎn)品，分光光度儀為美國Bio－Rad公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、吸管、離心管、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等為丹麥Nunc公司產(chǎn)品。

2．實(shí)驗(yàn)方法:(1)肝細(xì)胞的分離:參考Seglen兩步膠原酶灌注法分離肝細(xì)胞［4］。在無菌操作條件下，分離、結(jié)扎膽總管和肝動(dòng)脈;門靜脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，近端置18G穿刺導(dǎo)管并固定，連接啟動(dòng)循環(huán)灌流裝置后，分離下腔靜脈并插管，剪開胸腔夾閉肝上下腔靜脈。用37℃水浴預(yù)熱的無Ca2+的D－Hank's液(含125U/m l肝素，pH值調(diào)至7．4)進(jìn)行灌注，灌流速度30ml/min，灌注時(shí)間10min，此時(shí)肝臟應(yīng)均勻發(fā)白，然后用含0．05%膠原酶和7．5mmol/L氯化鈣(CaCl2)的 D－Hank's液灌注10min，灌注速度5ml/min，至肝包膜下組織呈龜背狀裂隙，兩步灌注時(shí)間共約20min左右。取下消化成熟的肝臟，輕輕撕去包膜，將肝細(xì)胞置入預(yù)冷4℃的D－Hank's液中，200目濾網(wǎng)過濾，制備成肝細(xì)胞懸液。以50g的離心速度離心5min，共離心3次。把收獲的肝細(xì)胞保存在含10%胎牛血清的RPMI－1640保存液中備用。將肝細(xì)胞懸液取樣在光鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算肝細(xì)胞產(chǎn)量，并用臺(tái)盼藍(lán)染色法測定肝細(xì)胞存活率?？刂拼诉^程時(shí)間在60min。(2)配制凍存液:凍存液為含12%二甲基亞砜(DMSO)、20%胎牛血清(FBS)的UW液和RPMI 1640液，預(yù)先分別用5%碳酸氫鈉溶液和0．1mmol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)其 pH 值為 7．1、7．4、7．7。(3)實(shí)驗(yàn)分組:共分為 6 組，1、2、3 組為 UW 液組，pH 值分別為7．1、7．4、7．7。4、5、6 組為 RPMI 1640 組，pH 值分別為 7．1、7．4、7．7。(4)肝細(xì)胞的冷凍保存:取新制備的肝細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至冷凍保存液中，冷凍保存液為含20%胎牛血清和12%二甲基亞砜(DMSO)的RPMI－1640細(xì)胞保存液，調(diào)節(jié)細(xì)胞最終濃度為5．0×106/m l，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，將細(xì)胞移入無菌塑料冷凍保存管中，每管為2ml。將冷凍保存管4℃ 放置15min，－20℃ 放置30min，－80℃放置12h，然后移入－196℃液氮中保存。(5)肝細(xì)胞的復(fù)蘇:分別于7、14、28天后，將冷凍保存期滿的細(xì)胞從液氮中取出，快速放入預(yù)熱至37℃的溫水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)使其盡快在1min內(nèi)融化。50g速度離心5min，取上清液測定LDH濃度，細(xì)胞加入含5%DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗，50g速度離心3min，去上清液，再加入含2%DMSO的細(xì)胞保存液沖洗，離心，去上清液，最后，用不含DMSO的細(xì)胞保存液進(jìn)行沖洗。離心后，去上清液，將細(xì)胞濃度調(diào)整至4×105個(gè)/毫升備用。

3．實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測:(1)肝細(xì)胞活率的測定:用臺(tái)盼藍(lán)染色法在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)3次，取平均值，通過計(jì)算活細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)再計(jì)算出肝細(xì)胞的存活率。(2)肝細(xì)胞保存液乳酸脫氫酶(LDH)濃度的測定:肝細(xì)胞樣本復(fù)蘇操作后，每份樣本第1次離心后取上清液測定LDH濃度。(3)四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn):將肝細(xì)胞用含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液配成肝細(xì)胞懸液濃度為5×103個(gè)/毫升，以每孔1000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，每孔加入MTT溶液20μl(5mg/m l)，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，翻板法棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。然后培養(yǎng)板每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長，校正波長630nm，在分光光度計(jì)上測定各孔數(shù)值，記錄結(jié)果。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)分析軟件包，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差記錄各組檢查結(jié)果，各組之間用單因素方差分析(Bonferroni檢驗(yàn))進(jìn)行比較。以P＜0．05認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1．分離細(xì)胞的活率:分離的肝細(xì)胞平均數(shù)目為2．8×108。用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)分離細(xì)胞活率平均為 92．28%。

2．凍存一定時(shí)間后復(fù)蘇的各組肝細(xì)胞存活率:由表1可見，各組中，存活率以pH值7．4和pH值7．7組最高，在第7天時(shí)，以pH值7．4組為最高，與其他兩組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)，而在14、28天時(shí)pH值7．4與pH值7．7沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，均明顯高于pH值7．1組 (P＜0．05)。

3．凍存一定時(shí)間后復(fù)蘇的各組肝細(xì)MTT試驗(yàn)結(jié)果:各組中，MTT實(shí)驗(yàn)以 pH值7．4組為最高，但與pH值7．7組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)，兩組均明顯高于pH值7．1組，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)。UW液保存的肝細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果在7、14、28天均明顯高于RPMI 1640液(用pH值7．4的兩組比較)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)，見表2。

表1 各組肝細(xì)胞存活率(%)

表2 各組肝細(xì)MTT試驗(yàn)結(jié)果

4．凍存一定時(shí)間，解凍后凍存液LDH濃度:各組中，LDH濃度以pH值7．4與pH值7．7組最低，兩組沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)，均明顯高于pH值7．1組，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)。UW 液保存的肝細(xì)胞的LDH濃度在7、14、28天均明顯低于RPMI 1640液組(用pH值7．4的兩組比較)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0．05)，見表3。

表3 凍存液LDH濃度(U/L)

討 論

目前的研究表明，肝細(xì)胞移植可用于治療肝衰竭及多種肝臟相關(guān)的遺傳性代謝缺陷疾病。它還是實(shí)施肝臟導(dǎo)向體外基因治療的工具，基因技術(shù)的發(fā)展將對其產(chǎn)生巨大影響［5］。肝細(xì)胞移植的療效在一定程度上與肝細(xì)胞的質(zhì)量有直接的聯(lián)系，但目前肝細(xì)胞分離、保存技術(shù)仍不完善，缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［6］。保存肝細(xì)胞的成功與否取決于分離技術(shù)、細(xì)胞保存液、冷凍技術(shù)、降溫速度和冷凍保護(hù)劑等［7］。本實(shí)驗(yàn)用pH值不同的凍存液進(jìn)行細(xì)胞冷凍保存，以期能對肝細(xì)胞的保存方法有所改進(jìn)。

細(xì)胞低溫保存過程中，有氧代謝中止，無氧酵解過程代償增強(qiáng)，酵解產(chǎn)生的乳酸蓄積;ATP分解過程中也會(huì)產(chǎn)生H+(MgATP2－→MgADP－+Pi2+H+);同時(shí)胞質(zhì)Ca2+增多，可促使Ca2+進(jìn)入線粒體并與其中的磷酸結(jié)合，在結(jié)合過程中也產(chǎn)生H+［3Ca2++，這些變化都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸中毒，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)pH值的下降［8］。細(xì)胞內(nèi)酸中毒的進(jìn)展及pH值下降能抑制糖酵解關(guān)鍵酶1，6－二磷酸果糖激酶，減少細(xì)胞內(nèi)ATP儲(chǔ)存，改變細(xì)胞能量代謝狀態(tài)，最終對保存細(xì)胞的活力產(chǎn)生影響。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)H+濃度升高，H+－K+交換增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)K+蓄積。細(xì)胞酸中毒還可直接或間接破壞膜系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷，甚至死亡。維持在中性或略偏堿性的保存液有利于細(xì)胞內(nèi)的H+通過一系列復(fù)雜的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制向細(xì)胞外流動(dòng)，緩解細(xì)胞內(nèi)的酸中毒，使肝細(xì)胞內(nèi)pH值保持穩(wěn)定。同時(shí)保存液保持中性或偏堿，可以促進(jìn)K+內(nèi)移，減輕K+的細(xì)胞毒作用。這樣的pH值環(huán)境還能減輕對糖酵解關(guān)鍵酶1，6－二磷酸果糖激酶的抑制，減慢ATP分解。從而提高肝細(xì)胞存活能力［9］。本實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，無論是在UW液還是1640液，中性和堿性環(huán)境的保存效果都明顯優(yōu)于偏酸性環(huán)境，在較長期(14、28天)，這種分別更加明顯。

雖然在肝移植和肺臟低溫灌注的研究表明，偏堿性的灌注液的保存效果要優(yōu)于中性灌注液，但在本實(shí)驗(yàn)中沒能觀察到這種結(jié)果，僅在28天后的標(biāo)本檢測中，偏堿性的UW保存組的LDH漏出要少于其他組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這可能是因?yàn)榧?xì)胞在凍存時(shí)的代謝水平較器官移植時(shí)更低，因而細(xì)胞內(nèi)的酸中毒程度較輕，可以被保存液中的緩沖系統(tǒng)代償。但在長期保存時(shí)，細(xì)胞的酸中毒超過保存液的緩沖能力，必然會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。所以在長期細(xì)胞保存時(shí)，選用緩沖能力強(qiáng)的保存液或使用偏堿性的保存液將能改善細(xì)胞的保存效果。

同時(shí)在實(shí)際的操作中，要取得精確控制的pH值是很難的，這就在很多時(shí)候需要我們有一定的趨向。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在略偏堿性pH值7．7環(huán)境中，肝細(xì)胞的凍存效果接近于中性環(huán)境。偏酸性環(huán)境pH值7．1不利于肝細(xì)胞的長期保存。也提示細(xì)胞保存液應(yīng)當(dāng)設(shè)置在pH值7．4或略偏堿性。

本實(shí)驗(yàn)也可以發(fā)現(xiàn)，雖然保存液的pH值是影響肝細(xì)胞保存的一個(gè)因素，但同時(shí)我們在各組數(shù)據(jù)的對比中可以發(fā)現(xiàn)，各組之間結(jié)果的差距并不是很大，這說明pH值是影響肝細(xì)胞保存效果的一個(gè)因素，但可能并不是關(guān)鍵因素，還需要研究其他因素對肝細(xì)胞保存效果的影響，以求能進(jìn)一步改進(jìn)肝細(xì)胞的保存技術(shù)。

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