復(fù)合抑菌劑對希瓦氏菌抑制效果的研究

高 瑩，婁永江

（寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波315211）

復(fù)合抑菌劑對希瓦氏菌抑制效果的研究

高 瑩，婁永江

（寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波315211）

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計原理，考察了四種抑菌劑多糖、納米銀、茶多酚與ε-聚賴氨酸對腐敗菌希瓦氏菌 （Shewanella sp.）的抑制作用。結(jié)果表明復(fù)合抑菌劑最佳配比為0.23%R-多糖、0.83‰納米銀、0.16‰茶多酚與0.43‰ε-聚賴氨酸，在此條件下抑菌率實測可達(dá)90%以上，且希瓦氏菌對該復(fù)合抑菌劑極度敏感，抑菌圈直徑達(dá)到28.36mm。

希瓦氏菌，抑菌劑，響應(yīng)面，管蝶法

水產(chǎn)品原料易于腐敗變質(zhì)，且微生物是造成其腐敗變質(zhì)的主要原因之一[1-2]。但是，并非所有微生物均是導(dǎo)致制品發(fā)生變質(zhì)的直接原因，往往只有一種或幾種特定微生物在整個腐敗過程中起著主導(dǎo)作用，該菌即稱之為特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）。故若加強對SSO的研究與控制，就可較好地降低水產(chǎn)品腐敗速率，提高產(chǎn)品品質(zhì)[3-5]。國內(nèi)外對SSO的研究表明，希瓦氏菌（Shewanella sp.）或假單胞菌（Pseudomonas sp.）是導(dǎo)致溫帶海洋魚類貯藏期間特別是冷藏時腐敗變質(zhì)的主要原因[6-10]，但針對這些腐敗菌進(jìn)行抑制的研究卻較少。本文利用響應(yīng)面法，研究了幾種抑菌劑對希瓦氏菌生長繁殖的影響，以期為海產(chǎn)品的保鮮提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

希瓦氏菌ANA-3（Shewanella sp.ANA-3） 分離自腐敗槍烏賊，經(jīng)生理生化及16s RNA鑒定得到，斜面保存于冰箱備用；納米銀溶液 采用化學(xué)還原法制得，濃度為200μg/mL，顆粒直徑≤15nm；ε-聚賴氨酸 浙江銀象生物工程有限公司；茶多酚 余姚市惠得隆生物制品有限公司；R-多糖 北京星標(biāo)智生物技術(shù)有限公司。將上述抑菌劑按實驗要求，配制成溶液保存于試劑瓶中備用。并將抑菌液OD420mm與純水OD420mm進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)無顯著差異（P＞0.05）。說明待測抑菌液對實驗測定結(jié)果無顯著性影響。

分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 取一菌環(huán)希瓦氏菌，接種于300mL營養(yǎng)肉湯，30℃培養(yǎng)18~20h后，血球計數(shù)板計數(shù)，根據(jù)實驗要求用滅菌營養(yǎng)肉湯稀釋至適當(dāng)濃度。

1.2.2 不同抑菌劑對希瓦氏菌生長影響測定 當(dāng)希瓦氏菌培養(yǎng)至進(jìn)入對數(shù)生長期（約3h）時，分別添加不同濃度抑菌劑，在30℃搖床中繼續(xù)培養(yǎng)24h后，測定菌液OD420mm。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化抑菌劑組合方案 采用Design-Excerpt7.0.0軟件，按照中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計（CCD）原理，以抑菌率作為響應(yīng)值，設(shè)計四因素二次旋轉(zhuǎn)組合實驗，優(yōu)化抑菌劑組合方案。實驗安排及抑菌率計算公式如下：

抑菌率（%）=（OD420對照組-OD420實驗組）/OD420對照組×100%

表1 四因素響應(yīng)面分析實驗因素設(shè)計表Table 1 Variables and levels in central composite design

1.2.4 組合抑菌劑敏感性測定 在超凈工作臺內(nèi)，于每個培養(yǎng)皿中倒入約15mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，移取0.2mL希瓦氏菌菌液均勻涂布，靜置30min后放入牛津杯，并在牛津杯中加入抑菌劑混合液0.2mL，30℃培養(yǎng)12h，測量抑菌圈直徑。并以無菌生理鹽水作陰性對照、1.00%山梨酸鉀作陽性對照[11-12]。每種抑菌劑做3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抑菌劑抑制希瓦氏菌效果

圖1 不同抑菌劑對菌液OD420值的影響Fig.1 OD420nmvalueofShewanellaatdifferentbacteriostaticagents

由圖1知，當(dāng)R-多糖、茶多酚、ε-聚賴氨酸以及納米銀的濃度分別小于0.20%、0.15‰、0.4‰、0.8‰時，菌液OD420mm值隨著抑菌劑濃度的增加顯著降低（P＜0.05），但當(dāng)各抑菌劑濃度超過該臨界點時，測定指標(biāo)雖呈現(xiàn)下降趨勢，但并不顯著（P＞0.05）。出于成本考慮，本研究分別以0.20%、0.15‰、0.4‰、0.8‰作為R-多糖、茶多酚、ε-聚賴氨酸及納米銀的實驗控制點。

2.2 組合抑菌劑配比條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 模型建立與顯著性分析 模型可信性分析顯示（見表3），模型校正決定系數(shù)R2adj=0.9705，說明所建模型可解釋97.05%響應(yīng)值的變異性；變異系數(shù)C.V=1.42%與精密度A.P=24.037，均在可接受范圍內(nèi)，說明該實驗可信度與精密度均較高；此外，該實驗?zāi)Ｐ蛿M合檢測高度顯著（P回歸模型＜0.01），模型失擬性不顯著（P失擬項＞0.05），說明該模型可較好反映實驗自變量對應(yīng)變量的影響，實驗結(jié)果中無異常點，可用來預(yù)測實驗響應(yīng)值的變化。

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表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Central composite experimental design matrix and experimental results

二次回歸模型為：

其中，二次項的系數(shù)表明所建拋物面開口向下，具有極大值點，可進(jìn)行最優(yōu)分析。四因素一次項與二次項對抑菌率均有非常顯著的影響（P＜0.05），且根據(jù)F值可知，影響性X1＞X4＞X2＞X3；X1X2、X2X3與X2X4的交互作用顯著，而X1X3、X1X4與X3X4的交互作用不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 因素作用分析

2.2.2.1 單因素效應(yīng)分析 因素X1、X2、X3與X4對Y值均有顯著性影響，故采用降維分析法，對4因素均進(jìn)行單因子效應(yīng)分析。單因素效應(yīng)方程與曲線如表4與圖1所示。

表4 單因素效應(yīng)方程Table 4 Effect equations of single factor

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression model

圖2可見，4因素對響應(yīng)值的影響均表現(xiàn)為曲線變化，且抑菌劑濃度發(fā)生相同編碼值變化幅度時，X1對抑菌率的影響效應(yīng)最大，X3影響效應(yīng)最小，這與前面的方差分析結(jié)果一致。此外，當(dāng)編碼值達(dá)到表4中X分界點時，各個方程對應(yīng)的響應(yīng)值達(dá)到最大值；當(dāng)編碼值小于X分界點時，各因素呈現(xiàn)正效應(yīng)；大于X分界點時，呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)。

圖2 單因素效應(yīng)曲線Fig.2 Effect curves of single factor

2.2.2.2 交互作用分析 實驗所得RSM三維圖以及相應(yīng)等高線見圖3～圖8。其中，等高線形狀表明不同因素之間交互作用強弱，橢圓表明兩者交互作用顯著，圓形表明交互作用不具有顯著性[13]，由此可得X1X2、X2X3與X2X4的交互作用顯著，這與方差分析結(jié)果一致。這可能是由于納米銀離子可使細(xì)胞膜松散、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而形成通道，有利于其它抑菌劑進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)從而更加有效的達(dá)到抑制微生物生長繁殖的作用[14-15]。因此，只對X1X2、X2X3與X2X4之間的交互作用進(jìn)行分析。將另兩個因素固定在零水平，得到X1X2、X2X3與X2X4對抑菌率影響的方程如下：

此外，將方程與等高線結(jié)合可知，在所考察范圍內(nèi)，抑菌率隨著各抑菌劑濃度的增加先增大，但當(dāng)抑菌劑濃度達(dá)到一定程度后，抑菌率隨各因素變化的幅度趨于平緩。

圖3 R-多糖與納米銀響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface for the interactive effects of R-polysaccharide and nano silver on the bacteriostatic rate

圖4 R-多糖與茶多酚響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface for the interactive effects of R-polysaccharide and tea polyphenol on the bacteriostatic rate

圖5 R-多糖與ε-聚賴氨酸響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface for the interactive effects of R-polysaccharide and ε-polylysin on the bacteriostatic rate

圖6 納米銀與茶多酚響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface for the interactive effects of nano silver and tea polyphenol on the bacteriostatic rate

圖7 納米銀與ε-聚賴氨酸響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface for the interactive effects of nano silver and ε-polylysin on the bacteriostatic rate

圖8 茶多酚與ε-聚賴氨酸響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface for the interactive effects of tea polyphenol and ε-polylysin on the bacteriostatic rate

聯(lián)立方程，解得X1=0.534，X2=0.602，X3=0.235，X4=0.561，換算可知當(dāng)R-多糖、納米銀、茶多酚與ε-聚賴氨酸的濃度分別為0.23%、0.83‰、0.16‰和0.43‰時，抑菌率達(dá)到最優(yōu)值91.02%。

在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗證實驗，得到的抑菌率為90.48%±0.09%，與預(yù)測值91.02%基本一致，說明所擬合模型可靠，優(yōu)化效果顯著，該實驗設(shè)計適用于對復(fù)合抑菌劑組合方案進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。

2.3 抑菌劑敏感性測定

管蝶法結(jié)果如表5所示。表明腐敗菌希瓦氏菌對組合抑菌劑以及山梨酸鉀均表現(xiàn)出敏感性，但對復(fù)合抑菌劑更為敏感。

表5 抑菌劑抑菌效果Table 5 Inhibition results of different bacteriostatic agents

圖9 希瓦氏菌對不同抑菌劑敏感度測定結(jié)果圖Fig.9 The sensitivity results of Shewanella for different bacteriostatic agents

3 結(jié)論

3.1 通過響應(yīng)面方法分析R-多糖、納米銀、茶多酚與ε-聚賴氨酸4因素對腐敗菌希瓦氏菌抑制作用的影響，得到相應(yīng)回歸方程如下：

Y=88.47+3.02X1+2.75X2+0.81X3+2.94X4+0.61X1X2-0.061X1X3-0.40X1X4+0.68X2X3+0.69X2X4-0.23X3X4-2.95X12-3.01X22-2.25X32-2.75X42

方差分析顯示，該模型擬合顯著，相關(guān)性好，決定系數(shù)R2=0.9848，且失擬性不顯著，說明所建方程可較好地預(yù)測抑菌率隨各因素變化情況。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳抑菌劑組合方案為：0.23% R-多糖、0.83‰納米銀、0.16‰茶多酚與0.43‰ε-聚賴氨酸，此條件下抑菌率預(yù)測達(dá)到91.02%。

3.3 在優(yōu)化條件下，抑菌率實測值為90.48%±0.09%，與預(yù)測值一致，說明響應(yīng)面法的合理性與可行性。且牛津杯實驗表明，希瓦氏菌對復(fù)合抑菌劑表現(xiàn)出極高的敏感度，效果顯著優(yōu)于1.00%山梨酸鉀。這可能是由于納米銀具有破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、增加細(xì)胞通透性的作用，從而更有益于其它抑菌劑進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)達(dá)到更加有效的抑菌效果，但具體抑菌機制仍需進(jìn)一步的研究與探討。

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Study on antimicrobial effect of different bacteriostatic agents on Shewanella sp.

GAO Ying，LOU Yong-jiang
（Faculty of Life Science and Biotechnology of Ningbo University，Ningbo 315211，China）

On the basis of single-factor experiments，bacteriostasis effects of four bacteriostatic agents（polysaccharide，nano silver，tea polyphenol and ε-polylysin）on Shewanella sp.were studied by using the principle of central composite design.Results showed that the optimal amounts of R-polysaccharide，nano silver，tea polyphenol and ε-polylysin was 0.23%，0.83‰，0.16‰ and 0.43‰，respectively.With this compound bacteriostatic agents，the bacteriostatic rate was more than 90%.And the diameter of inhibition zone was 28.36mm，which indicated Shewanella sp.was sensitive for this complex preservative.

Shewanella sp.；bacteriostatic agent；response surface methodology；cylinder-plate method

TS202.3

A

1002-0306（2012）07-0088-05

2011－07－08

高瑩（1987-），女，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

浙江省“十一五”科技興海重大科技項目（2009C03017-3）；寧波市農(nóng)業(yè)重大攻關(guān)招標(biāo)項目（2006C11001）