山茱萸籽總黃酮的響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取工藝的研究

劉瑞林，詹漢英，張志琪

（藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室，陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，陜西西安710062）

山茱萸籽總黃酮的響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取工藝的研究

劉瑞林，詹漢英，張志琪*

（藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室，陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，陜西西安710062）

目的：利用微波輔助提取技術(shù)對山茱萸籽總黃酮的提取工藝進行研究。方法：以蘆丁為對照品，采用紫外-分光光度法測定山茱萸籽中總黃酮的含量，以總黃酮含量為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法（RSM）優(yōu)化山茱萸籽總黃酮的提取工藝。結(jié)果：優(yōu)化的山茱萸籽總黃酮微波輔助提取工藝參數(shù)為：微波功率350W，乙醇體積分數(shù)50%，液料比20mL/g，提取時間13min。在此最佳條件下，山茱萸籽總黃酮的一次提取率為6.68%。結(jié)論：山茱萸籽含有較高的總黃酮含量，所確定的提取工藝提取率高、速度快、操作簡便。

微波輔助提取，山茱萸籽，總黃酮，響應(yīng)曲面法（RSM）

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茱萸果核 購于西安百姓大藥房，水分含量0.3%，產(chǎn)地為河南；蘆丁 天津一方科技有限公司，含量＞99%；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、石油醚、無水乙醇 均為分析純。

FW400A高速萬能粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司；XO-SM200超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FA電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；ZK-82A電熱真空干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 將山茱萸籽粉碎后過60目篩，精確稱取10g樣品裝入濾紙筒中，封口處加少許脫脂棉，細線扎緊，置于索氏浸提管內(nèi)，高度不超過虹吸管，以無水乙醚為脫脂劑，于45℃水浴鍋中脫脂20h，充分除去樣品中脂類和脂溶性色素后，將濾紙包取出，先用電吹風(fēng)吹干，再置烘箱中60℃烘2h備用。

1.2.2 山茱萸籽總黃酮提取工藝流程 山茱萸籽脫脂粉末→乙醇浸提回流→抽濾得濾液→定容→測定溶液吸光度

1.2.3 提取實驗設(shè)計 本實驗在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選取微波功率、乙醇體積分數(shù)、液料比以及提取時間4個主要影響山茱萸籽總黃酮提取率的因素，每個因素選取高、中、低三個水平，各實驗組的編碼與取值見表1，共27個實驗點，其中24個為析因點，3個為零點，零點實驗進行3次，作誤差估計。按照響應(yīng)曲面法中的Box-Behnken設(shè)計方案（表2），依次進行實驗，以山茱萸籽總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，對實驗結(jié)果進行分析，建立二次多項式數(shù)學(xué)模型：

其中，Y為山茱萸籽總黃酮提取率預(yù)測響應(yīng)值，Xi和Xj為自變量，β0為常數(shù)項，βi為線性系數(shù)，βij為交互項系數(shù)，βii為二次項系數(shù)。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Variables and levels of the three-variable，three-level Box-Behnken design

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0mg，用質(zhì)量分數(shù)75%的乙醇溶液于100mL容量瓶中定容。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0、4.0mL于10mL棕色容量瓶中，分別加入0.4mL質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO2溶液，搖勻、放置6min后加入0.4mL質(zhì)量分數(shù)10%的Al（NO3）3溶液，搖勻靜置6min后加入4mL質(zhì)量分數(shù)4%的NaOH溶液，放置15min，用75%乙醇稀釋至刻度，10min后以75%乙醇為空白，在200~700nm掃描，考察最大吸收波長范圍，并在最大吸收波長下分別測定不同濃度的蘆丁的吸光度，平行實驗三次。以吸光度為縱坐標(biāo)，總黃酮含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 山茱萸籽總黃酮提取 精密稱取脫脂山茱萸籽粉約5.0g，置于250mL反應(yīng)瓶中，加入一定比例體積分數(shù)的乙醇提取溶劑，按照圖1所示，連接好回流裝置，按照響應(yīng)曲面法中的Box-Behnken設(shè)計方案進行實驗（表2），按所設(shè)計的不同實驗條件提取山茱萸籽總黃酮，并回流冷凝，過濾洗滌得濾液，濾液濃縮定容于250mL容量瓶中。精密吸取0.5mL該試液于10mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法在最大吸收波長處測定其吸光度，并計算總黃酮的含量。

圖1 山茱萸籽總黃酮的微波輔助提取裝置Fig.1 The Cornus officinalis seed total flavonoids microwave-assisted extraction device

1.2.6 樣品的測定 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉法[8]，準(zhǔn)確移取0.5mL供試樣品溶液，置于10mL棕色容量瓶中，按上述1.2.4方法測定。以試劑空白作參比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣液總黃酮提取率。

總黃酮提取率（%）=2m1/（m總×103）×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長的確定

按照1.2.4的方法，在200~700nm波長處對蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進行紫外光譜掃描，得到如圖2的掃描圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最大吸收波長約為510nm。

圖2 蘆丁的紫外吸收光譜Fig.2 The rutin UV absorption spectrum

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及其回歸方程

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3），并進行線性回歸，得回歸方程為：y=11.094x+0.02，其中：x為蘆丁溶液濃度，y為吸光度；R2=0.9995，線性范圍為0.004~0.08mg/mL，其線性關(guān)系良好。

2.3 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果與分析

2.3.1 回歸模型方程的建立及顯著性檢驗 根據(jù)響應(yīng)曲面法Box-Benhnken設(shè)計（BBD），共27個實驗點進行實驗，山茱萸籽總黃酮的提取率見表2。使用Design-expert software 7.1.3 Trial（State-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA）軟件進行數(shù)據(jù)分析，以山茱萸籽總黃酮的提取率為響應(yīng)值，得到的多元二次回歸模型方程為：

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Rutin standard curve

表2 BBD實驗設(shè)計和實驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and observed responses

該模型的回歸分析見表3。根據(jù)模型的P<0.05，F(xiàn)模型= 70.52＞F0.05（14.3）=8.71，說明實驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性；失擬項用來檢測回歸模型與實際實驗值擬合程度的好壞，如果失擬項顯著，說明對響應(yīng)值有影響的還有其它因素?？傸S酮提取率的失擬項P=0.1118＞0.05，表明失擬不顯著。由此可見，該模型能夠較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。該回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)為R2Adj=0.9740，即該模型能解釋97.40%響應(yīng)值的變化，模型擬合程度良好，實驗誤差小，說明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化山茱萸籽總黃酮的提取模型條件是可行的。此外，還可以明顯看出，X1、X2、X3、X4、X1X3、X1X4、X2X3、X12、X22、X32和X42具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），即微波功率、乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間的一次項，微波功率與液料比的交互項、微波功率與提取時間的交互項、乙醇體積分數(shù)與液料比的交互項，微波功率、乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間的二次項均對山茱萸種籽總黃酮的提取率有顯著影響。

表3 擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis result of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

2.3.2 響應(yīng)曲面分析 根據(jù)模型方程繪制響應(yīng)曲面圖、標(biāo)準(zhǔn)殘差圖及模型預(yù)測值/實驗值擬合曲線圖，結(jié)果見圖4（A-H）。從響應(yīng)曲面圖中可以明顯地看出各獨立變量之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。從標(biāo)準(zhǔn)殘差圖及模型預(yù)測值/實驗值擬合曲線可直觀地看出所建立模型與實驗值的擬合情況。

圖4A為微波功率和乙醇體積分數(shù)對山茱萸籽總黃酮提取率的影響，當(dāng)液料比為20∶1mL/g、提取時間為10min時，圖中乙醇體積分數(shù)對山茱萸籽總黃酮提取率的影響比較顯著，其曲線呈上升趨勢，且變化幅度較大，但在乙醇體積分數(shù)為50%處提取率開始緩慢下降。微波功率的曲線較平緩，表明其對提取率影響較小。從等高線圖中可以看出微波功率與乙醇體積分數(shù)的交互作用對山茱萸籽總黃酮提取率的影響不顯著。由圖4A可確定最佳水平范圍：微波功率320~ 400W，乙醇體積分數(shù)50%~60%。

圖4B為乙醇體積分數(shù)50%、提取時間10min時液料比和微波功率對山茱萸籽總黃酮提取率的影響，從圖中可以看出，液料比對山茱萸籽總黃酮提取率的影響比較顯著，其曲線呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。微波功率的曲線較平緩，表明其對提取率影響較小。由此可確定最佳的水平范圍液料比為20~25mL/g，微波功率320~400W。

圖4C為微波功率和提取時間對山茱萸籽總黃酮提取率的影響，提取時間、微波功率的二次項對山茱萸籽總黃酮提取率的影響十分顯著。從等高線圖中可以看出微波功率與提取時間的交互作用對山茱萸籽總黃酮提取率的影響極顯著。從圖中可確定最佳的水平范圍為微波功率320~400W，提取時間10~ 15min。

圖4D為乙醇體積分數(shù)和液料比對山茱萸籽總黃酮提取率的影響，乙醇體積分數(shù)、液料比的二次項對山茱萸籽總黃酮的提取率的影響十分顯著。從圖中可確定最佳的水平范圍為乙醇體積分數(shù)50%~60%，液料比為20~25mL/g。

圖4E為乙醇體積分數(shù)和提取時間對山茱萸籽總黃酮提取率的影響，從圖中可確定最佳的水平范圍為乙醇體積分數(shù)50%~60%，提取時間10~15min。

圖4 山茱萸籽總黃酮提取條件的響應(yīng)曲面及標(biāo)準(zhǔn)殘差圖Fig.4 Response surface plots and normal plot of residuals for optimizing the Cornus officinalis seed total flavonoids extraction condition

圖4F為液料比和提取時間對山茱萸籽總黃酮提取率的影響，從圖中可確定最佳的水平范圍為液料比為20~25mL/g，提取時間10~15min。

圖4G與4H分別為標(biāo)準(zhǔn)殘差圖與模型預(yù)測值/實驗值擬合曲線圖，從圖4G可以看出，響應(yīng)值與實驗值擬合較好（0.05＜p＜F）。從圖4H可以看出，實驗值與預(yù)測值幾乎在一條直線上，表明模型能夠較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以利用該模型確定最佳提取工藝條件。

通過對模型方程求導(dǎo)計算，得到山茱萸籽總黃酮提取的最佳條件為：微波功率353.29W，乙醇體積分數(shù)50.53%，液料比19.76mL/g，提取時間13.05min。在此最佳條件下，山茱萸籽總黃酮的一次理論提取率為7.21%?？紤]到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為微波功率350W，乙醇體積分數(shù)50%，液料比20mL/g，提取時間13min，3次平行實驗得到的實際平均得率為6.78%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法對微波輔助提取山茱萸籽總黃酮的工藝進行了優(yōu)化，在所確定的工藝條件下山茱萸籽總黃酮的一次提取率達到6.68%，其含量介于山茱萸肉總黃酮含量的3.84%~8.61%[9-10]。說明山茱萸籽具有較好的藥用、保健功能；此外，該方法萃取時間短、提取率高，表明響應(yīng)曲面優(yōu)化微波輔助提取工藝條件更科學(xué)、有效，該研究為山茱萸籽的開發(fā)利用提供了一定的參考。

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Optimization of microwave-assisted extraction of total flavonoids from Cornus officinalis seed by response surface methodology

LIU Rui-lin，ZHAN Han-ying，ZHANG Zhi-qi*
（Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry of Ministry of Education，School of Chemistry and Chemical Engineering，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Objective：A microwave-assisted extraction（MAE）method was studied for the extraction technology of total flavonoids from Cornus officinalis seed.Method：The total flavanoids contents of Cornus officinalis seed was determined by using ultraviolet-spectrophotometry method with rutin as reference substance.Using the content of total flavonoids in dry extract as a major evaluating factor，the best combination of extraction parameters was obtained with response surface methodology（RSM）.Results：The best extraction parameters were as follows：microwave power 350W；alcohol concentration 50%；solvent to sample ratio 20mL/g；extraction time 13min.Under these best conditions，the extraction yield of Cornus officinalis seed total flavonoids was 6.68%.Conclusion：The Cornus officinalis seed contain much higher total flavonoids content，and the technology had many advantages such as high yield，high speed，simple operation and so on.

microwave-assisted extraction；Cornus officinalis seed；total flavonoids；response surface methodology（RSM）

TS201.1

B

1002-0306（2012）07-0228-04

山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）為山茱萸科落葉灌木或小喬木，是一種常用的名貴中草藥。山茱萸性味酸、澀、微溫，歸肝腎經(jīng)，具補益肝腎、澀精固脫之功效[1]。目前，對山茱萸果肉的化學(xué)成分已有較多研究，發(fā)現(xiàn)山茱萸肉中含有環(huán)烯醚萜苷、有機酸、鞣質(zhì)以及維生素、氨基酸和揮發(fā)油等多種藥用及營養(yǎng)保健成分[2-4]；但對山茱萸籽的相關(guān)研究報道較少。黃酮類化合物具有止咳、平喘、祛痰、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老及保護心血管的作用[5-6]。目前，黃酮類化合物的提取方法主要有溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法、酶解法、超臨界流體萃取法、雙水相萃取分離法和半仿生提取法等。微波輔助提取法具有選擇性高、提取時間短、易揮發(fā)性成分的提取率高以及不需要特殊分離步驟等優(yōu)點[7]，但尚未見到山茱萸籽總黃酮微波輔助提取的研究報道。本實驗采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法（RSM）對微波輔助提取山茱萸籽總黃酮的工藝條件進行了研究，同時以蘆丁為對照品，采用紫外-分光光度法對山茱萸籽總黃酮的含量進行測定，旨在為開發(fā)利用山茱萸籽這一豐富的天然藥物資源提供參考依據(jù)。

2011－06－29 *通訊聯(lián)系人

劉瑞林（1987-），男，碩博連讀研究生，主要從事天然藥物化學(xué)有效成分研究。

國家自然科學(xué)基金資助項目（20875060）。