雌激素改善大鼠記憶及促進(jìn)海馬BDNF蛋白表達(dá)上調(diào)

唐明山

（重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 401320）

雌激素改善大鼠記憶及促進(jìn)海馬BDNF蛋白表達(dá)上調(diào)

唐明山

（重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 401320）

目的探討雌激素改善大鼠記憶與BDNF表達(dá)的關(guān)系。方法停止繁殖的15月齡雌性大鼠，體質(zhì)量350～400g，隨機(jī)分為治療組和對照組，在頸部皮下分別注射相同劑量的苯甲酸雌二醇和生理鹽水。采用Morris水迷宮檢測大鼠記憶，大鼠海馬BDNF、TrkB及mRNA表達(dá)采用RT－PCR檢測，BDNF、TrkB及proBDNF蛋白表達(dá)采用Western－blot檢測。結(jié)果治療組大鼠潛伏期縮短，海馬BDNF、TrkB、proBDNF表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論雌激素改善大鼠記憶，可能與BDNF及相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

雌激素；記憶；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

研究表明，腦源性神經(jīng)生長因子（brain－derived nerve growth factor，BDNF）與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)［1－2］，BDNF是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。有關(guān)運用雌激素改善記憶的研究頗多，盡管結(jié)論不一，多數(shù)研究認(rèn)為，絕經(jīng)后婦女血漿雌激素水平降低可能使認(rèn)知功能惡化［3］，至少在絕經(jīng)后特定的時間窗內(nèi)，雌激素替代治療能改善認(rèn)知功能［3－4］。有關(guān)雌激素改善認(rèn)知功能的機(jī)理尚不清楚，結(jié)合BDNF與記憶的關(guān)系，本研究觀察雌激素治療后大鼠海馬BDNF、高親和受體酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）和BDNF前體蛋白（precursor protein of brain－derived neurotrophic facton，proBDNF）表達(dá)的變化，了解其與大鼠記憶改變的關(guān)系，探討雌激素替代治療影響絕經(jīng)后大鼠認(rèn)知功能的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 93只清潔級Sprague－Dawley雌性大鼠，15月齡左右，已自然停止繁殖2個周期，體質(zhì)量350～400 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供。隨機(jī)分為治療組和對照組，每組各35只，備用8只（每組4只），7只在手術(shù)中或術(shù)后死亡。每組在7d和30d兩個時相點進(jìn)行觀測。

1.2 模型制備 先將所有大鼠在實驗前放入不放置水下平臺的水迷宮中游泳4次（上下午各2次），剔除原地打轉(zhuǎn)的大鼠8只后，隨機(jī)分為雌激素替代治療組及對照組。模型制備按有關(guān)文獻(xiàn)［5］，雌激素替代治療組切除雙側(cè)卵巢，對照組按相同方法打開腹腔，找到卵巢后不切除卵巢，關(guān)腹。所有手術(shù)操作均由同一實驗人員完成，避免不同人員操作引起的誤差。兩組大鼠于相應(yīng)時相點取材或行有關(guān)實驗。

1.3 動物飼養(yǎng) 手術(shù)完畢后的實驗動物在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心按組分籠喂養(yǎng)，每組每籠對編號、組別、數(shù)量、手術(shù)時間進(jìn)行標(biāo)識，5只大鼠為一籠進(jìn)行喂養(yǎng)，飼料由動物實驗中心提供普通大顆粒飼料，按每200g標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量大鼠每天進(jìn)食15g干飼料匡算，限量分籠投食，自由飲水，每天07：00～19：00保證光照12h，定時通風(fēng)，每日早、晚沖洗大鼠排泄物，空調(diào)調(diào)節(jié)室溫，使室溫保持在17℃～23℃。

1.4 給藥方法 實驗動物術(shù)后恢復(fù)1個月，從第17月齡開始，每日治療組大鼠頸部皮下注射苯甲酸雌二醇（estradiol benzoate，EB）25mg·kg－1·d－1［6］，對照組大鼠頸部皮下注射相同劑量生理鹽水。為保持大鼠血漿雌二醇濃度，避免雌二醇波動引起的認(rèn)知功能檢查的誤差，水迷宮實驗階段每日仍按上述方法進(jìn)行苯甲酸雌二醇或生理鹽水注射。

1.5 記憶功能檢測 采用中科院研制生產(chǎn)的Morris水迷宮（morris water maze，MWM）3.0對大鼠記憶功能檢測。實驗前1d為觀察其游泳姿勢及熟悉環(huán)境，讓大鼠自由游泳2min。訓(xùn)練開始時，將平臺置于NW象限，將大鼠面向池壁從池壁4個起始點的任一點放入水池，入水后系統(tǒng)自動錄像記錄游泳路徑（swimming pathlength）和大鼠找到平臺的游泳時間即逃避潛伏期（escape latency），每天分上、下午兩個時間段（blocks），每個時間段訓(xùn)練2次（trials），實驗歷時5d，每次大鼠爬上或被引到平臺后，在平臺上休息30s。同一次訓(xùn)練的全部大鼠采用相同的入水點，每次訓(xùn)練選取不同入水點。大鼠訓(xùn)練過程由系統(tǒng)自動記錄，在規(guī)定時間內(nèi)找不到平臺的大鼠，即將其引導(dǎo)到平臺，系統(tǒng)自動中止記錄，并將潛伏期計為150s。訓(xùn)練結(jié)束立即撤出平臺，進(jìn)行空間搜索實驗，150s內(nèi)大鼠在穿越原平臺次數(shù)、游泳時間百分比、在平臺象限游泳距離、大鼠的搜索策略。

1.6 分子生物學(xué)指標(biāo) BDNF、TrkB、mRNA：采用半定量（RT－PCR）檢測。全部引物由上海生工合成，BDNF引物序列：上游5′－AGC CTC CTC TGC TCT TTC TGC TGG A－3′，下游5′－CTT TTG TCT ATG CCC CTG CAG CCT T－3′；TrkB 引物序列：上游5′－ATT GAC CCA GAG AAC ATC AC－3′，下游5′－CAG GAA ATG GTC ACA GAC TT－3′；GADPH 為內(nèi)參照。proBDNF、BDNF及TrkB蛋白：采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測。一抗分別采用Chemicom International公司的兔抗鼠proBDNF（AB5613）及Santa Cruz Biotechnology公司的兔抗鼠 BDNF（N－20）：sc－546、兔抗鼠 TrkB，二抗采用Sigma公司的山羊抗兔IgG，采用美國DUPONT的化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑盒（western blot chemiluminescence reagent plus）。操作按分子生物學(xué)實驗操作第2版進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)釆用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。所有計量資料采用±s表示，組內(nèi)均數(shù)的顯著性檢驗釆用單因素方差分析（one way ANOVA），組間均數(shù)的顯著性檢驗釆用獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 雌激素能促進(jìn)絕經(jīng)后大鼠海馬表達(dá)BDNF mRNA和TrkB mRNA擴(kuò)增結(jié)果 GADPH片斷長度為598bp，BDNF擴(kuò)增片斷長度為297bp（圖1），TrkB擴(kuò)增片斷長度為467bp（圖2）。

圖1 大鼠海馬BDNF mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 大鼠海馬TrkB mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物

以GADPH內(nèi)參照單位密度值為10D/mm2，結(jié)果經(jīng)圖像掃描分析，校正后顯示：治療組大鼠海馬BDNF和TrkB mRNA明顯高于對照組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），組內(nèi)不同時相點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 大鼠海馬BDNF、TrkB mRNA相對積分光密度（±s）

表1 大鼠海馬BDNF、TrkB mRNA相對積分光密度（±s）

＊：P＜0.05，與對照組同時間段比較。

組別 時間（d）BDNF TrkB對照組7 0.722±0.047 0.801±0.030 30 0.651±0.096 0.732±0.050雌激素治療組 7 1.006±0.011＊1.175±0.015＊30 0.999±0.015＊1.166±0.018＊

2.2 雌激素能調(diào)節(jié)絕經(jīng)后大鼠海馬proBDNF、BDNF及TrkB蛋白表達(dá) 免疫印跡結(jié)果顯示，TrkB、proBDNF和BDNF蛋白免疫印跡蛋白相對分子質(zhì)量各為30、14和145kD，結(jié)果見圖3～5。

圖3 大鼠海馬BDNF前體及成熟蛋白表達(dá)結(jié)果（Western blot）

圖4 大鼠海馬BDNF前體蛋白表達(dá)結(jié)果（Western blot）

圖5 大鼠海馬TrkB蛋白表達(dá)結(jié)果（Western blot）

以對照組7d這一時相點單位密度值為10D/mm2，結(jié)果經(jīng)圖像掃描分析，校正后顯示：雌激素治療組海馬組織proBDNF、BDNF及TrkB表達(dá)水平均明顯高于對照組大鼠（P＜0.05），組內(nèi)不同時相點差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 血漿雌二醇水平比較 大鼠血漿雌二醇濃度在雌激素治療7d組為（66.92±10.78）pg/mL，大鼠血漿雌二醇濃度在對照組相應(yīng)時相點為（3.87±1.94）pg/mL；大鼠血漿雌二醇濃度在雌激素治療30d組為（64.89±10.09）pg/mL，大鼠血漿雌二醇濃度在對照組相應(yīng)時相點為（5.54±2.37）pg/mL，組內(nèi)時相點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 海馬proBDNF、BDNF及TrkB蛋白表達(dá)（±s）

表2 海馬proBDNF、BDNF及TrkB蛋白表達(dá)（±s）

＊：P＜0.05，與對照組同時間段比較。

組別 時間（d） proBDNF BDNF TrkB對照組7 1.000 1.000 1.000 30 0.951±0.096 1.032±0.050 1.131±0.030雌二醇治療組 7 2.006±0.011＊1.579±0.015＊1.975±0.015＊30 2.099±0.015＊1.661±0.018＊2.166±0.018＊

2.4 兩組大鼠水迷宮試驗成績比較 兩組大鼠定位航行實驗經(jīng)過水迷宮訓(xùn)練后游泳速度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；組內(nèi)不同時相點間大鼠游泳速度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明絕經(jīng)后大鼠的游泳速度并不能被雌激素替代治療改善。對兩組大鼠潛伏期比較，治療組找到平臺的潛伏期小于對照組（P＜0.05），治療30d的大鼠潛伏期小于治療7d的大鼠（P＜0.05）。說明治療組大鼠記憶力強(qiáng)于對照組，治療30d的記憶力更強(qiáng)（表3）。

表3 雌激素對大鼠定位航行實驗的影響（±s）

表3 雌激素對大鼠定位航行實驗的影響（±s）

＊：P＜0.05，與對照組同時間段比較；★：P＜0.05，與組內(nèi)7d時比較。

對照組 雌二醇治療組項目n7d 30d潛伏期（s） 10 16.39±4.76 17.06±5.24 12.01±3.18＊8.34±3.03 7d 30d＊★10.75游泳速度（cm/s） 10 35.18±10.2133.52±9.21 34.96±9.54 36.07±

3 討 論

本研究中，雌激素治療組手術(shù)后給予雌二醇治療后，治療組體內(nèi)雌激素水平高于對照組，大鼠找到平臺的潛伏期較對照組短，說明治療組大鼠對平臺的記憶比對照組好，雌激素治療改善了大鼠記憶功能。與Kiss等［7］的研究相符。研究中選取已經(jīng)絕經(jīng)的大鼠，主要考慮其雌激素水平較低，即使對照組假手術(shù)未切除卵巢，其體內(nèi)雌激素的水平與治療組給予的雌二醇量比較可以忽略不計，實驗結(jié)果能反應(yīng)雌激素對大鼠記憶的影響。

對雌激素替代治療改善認(rèn)知功能的機(jī)制，研究認(rèn)為雌激素可能通過抗凋亡、抗氧化、阻止淀粉樣斑的產(chǎn)生及促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌［8］，來影響認(rèn)知功能。有研究表明，大腦中BDNF表達(dá)受月經(jīng)周期影響［9］，提示BDNF的表達(dá)受雌激素影響。有關(guān)記憶的研究表明，記憶與突觸前和突觸后的長時程增強(qiáng)效應(yīng)（long－term potentiation，LTP）明確相關(guān)，BDNF能調(diào)節(jié)突觸傳遞和突觸可塑性，改變LTP［10］，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶功能。因此，在某種程度上，BDNF可作為記憶改善的分子標(biāo)志物。

本研究中，雌激素治療組大鼠BDNF基因及蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，雌激素可能通過促進(jìn)BDNF表達(dá)來影響大鼠的記憶。本研究中，治療組30d時相點大鼠與7d時相點大鼠比較，BDNF的基因和蛋白水平表達(dá)并未上調(diào)，其體內(nèi)雌激素濃度也無顯著差異，說明雌激素與BDNF表達(dá)一致。治療組定位航行的結(jié)果中，30d組大鼠潛伏期比7d組大鼠短，說明30 d組大鼠記憶好于7d組。分析原因：（1）可能是手術(shù)創(chuàng)傷對大鼠游泳速度有影響，30d大鼠手術(shù)恢復(fù)較好，受手術(shù)本身的影響較小。（2）一定時間內(nèi)雌激素持續(xù)替代治療時間的長短可能對記憶有一定影響。另外，大鼠的記憶可能還存在其他機(jī)制。

BDNF需與其受體結(jié)合才能發(fā)揮作用，因此，研究BDNF的表達(dá)離不開其高親和力受體TrkB，BDNF需要與其結(jié)合才能發(fā)揮作用，二者在海馬中表達(dá)均較高，它們結(jié)合后，使TrkB絡(luò)氨酸殘基自磷酸化，促發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)LTP［11］，影響學(xué)習(xí)記憶。TrkB的基因及蛋白表達(dá)上調(diào)均與BDNF一致，結(jié)果從另一方面表明，BDNF及受體TrkB蛋白表達(dá)上調(diào)，是雌激素記憶的可能機(jī)制。在神經(jīng)元突觸中，BDNF由其前體蛋白proBDNF而來［12］，因此，本研究也檢測了兩組大鼠海馬proBDNF蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素治療組大鼠proBDNF蛋白增強(qiáng)，與BDNF成熟蛋白表達(dá)一致。proBDNF蛋白表達(dá)增強(qiáng)也從另一方面表明雌激素能促進(jìn)BDNF表達(dá)，改善學(xué)習(xí)記憶功能。

本實驗中，雌激素替代治療能改善絕經(jīng)后大鼠記憶功能，促進(jìn)BDNF、高親和力受體TrkB及proBDNF蛋白表達(dá)，這些蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，可能是雌激素改善記憶的分子機(jī)制之一。

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Estrogen to improve rat memory and hippocampal BDNF protein expression upregulation

TangMingshan
（DepartmentofNeurology，theFirstPeople′sHospitalinBa＇nanDistrict，Chongqing401320，China）

ObjectiveTo explore the relation of estrogen on memory and expression of BDNF in hippocampus of postmenopausal rats.MethodsRats retired from breeding for two reproductive cycles，15－month－old，and 350－400g weight，were divided into two groups by random assigned method.Before testing，estradiol benzoate and the same capacity of normal saline was injected subcutaneouly on the cervical part of rats.memory of rats was detected by Morris water maze.RT－PCR and Western－blot wre respectively used to detect expression of BDNF mRNA，TrkB mRNA and protein of BDNF，TrkB and proBDNF hippocampus of postmenopausal rats.ResultsCompared with the control group，the rats of estrogen replacement therapy group showed a shorter escape latency（P＜0.05）Contrasted to the control group，expression of BDNF，TrkB and proBDNF protein in hippocampus increased（P＜0.05）.ConclusionMemory is enhanced in the rats received estrogen replacement therapy group in postmenopausal rats，it maybe related with high expression of BDNF and relational protein.

estrogen；memory；brain－derived nerve growth factor

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.23.016

A

1671－8348（2012）23－2386－03

2012－01－18

2012－02－28）