簡(jiǎn)便快速測(cè)定人體血漿中嗎啡含量的RP－HPLC法＊

黃洪勇，職曉燕，張瑞嶺△，師天元，2

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453002；2.河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng)453002）

簡(jiǎn)便快速測(cè)定人體血漿中嗎啡含量的RP－HPLC法＊

黃洪勇1，職曉燕1，張瑞嶺1△，師天元1，2

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453002；2.河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng)453002）

目的建立RP－HPLC法測(cè)定人體血漿中嗎啡的含量。方法色譜柱為美國(guó)Diamonsil?（250×4.6mm，5μm）C18反相柱；流動(dòng)相為甲醇－緩沖液（5mL三乙胺加入1 000mL水中，磷酸調(diào)pH值7.0）＝80∶20，流速為1.3mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)233 nm。結(jié)果嗎啡血漿濃度在1.8～921.6ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為C＝0.962 7F－0.019 6（r＝0.999 7，n＝8），定量下限1.8ng/mL。結(jié)論本方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以用于嗎啡臨床研究和不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

快速測(cè)定；嗎啡；反相高效液相色譜法

嗎啡（morphine）為阿片類生物堿，是一類具有依賴性的麻醉藥品。由于該藥品的特殊性，治療窗口窄，人體內(nèi)的含量測(cè)定在嗎啡濫用、依賴與戒斷相應(yīng)研究，尋找合適給藥途徑與藥動(dòng)學(xué)研究中意義重大。作者根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)方法，進(jìn)行條件優(yōu)化，建立了較為簡(jiǎn)便的人體血漿中嗎啡反相高效液相色譜（RP－HPLC）定量分析法，并應(yīng)用于人體血漿中嗎啡含量的測(cè)定。該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以廣泛滿足嗎啡的臨床研究和濫用快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀；瑞士XT－120A電子分析天平；丹麥ULTRE FREEZE－3410超低溫冰箱；江蘇XK96－A快速旋渦混合器；上海LXJ－II離心沉淀機(jī)。嗎啡對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：171201－200318）；內(nèi)標(biāo)物氯氮平（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：010K1204）；甲醇為色譜純；其余試劑為分析純；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：美國(guó)Diamonsil?（250×4.6mm，5 μm）C18反相柱，柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇－緩沖液（5mL三乙胺加入1 000mL水中，磷酸調(diào)pH值7.0）＝80∶20，流速：1.3 mL/min；測(cè)波長(zhǎng)：233nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備 取嗎啡對(duì)照品約10mg，精密稱定，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容刻度，即得。于冰箱4℃保存?zhèn)溆?，臨用前用甲醇稀釋成所需濃度。依法制備出10μg/mL氯氮平甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)液。

1.2.3 血漿樣品處理 取400μL含藥血漿加至10mL具塞錐形玻璃離心管中，加入內(nèi)標(biāo)液100μL，漩渦振蕩1min，加入乙酸乙酯5mL，漩渦振蕩提取2min，4 000r/min離心10 min，取有機(jī)層置于一干燥具塞尖底試管中，離心管中再加入乙酸乙酯5mL，同法操作。震蕩混合2次提取液，40℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μL流動(dòng)相復(fù)溶后，4 000r/min離心10 min，取20μL進(jìn)樣。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性考察 在上述色譜條件下，血漿內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物及其他雜質(zhì)不干擾主峰的分離和測(cè)定，內(nèi)標(biāo)和嗎啡保留時(shí)間分別為6.5min和11.2min。嗎啡的有效塔板數(shù)為5 000，分離度18.9，拖尾因子1.03。見圖1。

圖1 嗎啡測(cè)定色譜圖

圖2 嗎啡測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 線性關(guān)系考察及靈敏度試驗(yàn) 取空白血漿300μL共8份，分別加入嗎啡系列對(duì)照品溶液100μL，使血漿中藥物濃度分別相當(dāng)于 1.8、3.6、14.4、28.8、115.2、230.4、460.8、921.6ng/mL，振蕩混勻，然后按“1.2.3項(xiàng)”處理。以嗎啡血漿濃度C對(duì)峰面積的比值F（嗎啡峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C＝0.962 7F－0.019 6（r＝0.999 7，n＝8）。嗎啡在1.8～921.6ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，見圖2。當(dāng)S/N≥10時(shí)，最低定量限為1.8ng/mL。

2.3 回收率與精密度試驗(yàn) 取空白血漿3份，分別按“2.2項(xiàng)”制備14.4、115.2、460.8ng/mL的嗎啡血漿對(duì)照品溶液，然后按“1.2.3項(xiàng)”處理。每種濃度日內(nèi)平行測(cè)5次，3種濃度隔日測(cè)定1次，一共5次。分別計(jì)算日內(nèi)、日間精密度，并根據(jù)同一天內(nèi)低、中、高3個(gè)濃度血漿對(duì)照品結(jié)果計(jì)算相對(duì)回收率；另配14.4、115.2、460.8ng/mL對(duì)照品溶液，以此為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算嗎啡的絕對(duì)回收率，結(jié)果見表1。

表1 血漿中嗎啡測(cè)定的回收率及精密度（n＝5）

2.4 凍融穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別按“2.2項(xiàng)”制備低、中、高濃度（14.4、115.2、460.8ng/mL）的嗎啡血漿質(zhì)控樣品若干份，分別在室溫放置0、2、4、6、12h，反復(fù)凍融0、1、2、3、4次，于－20℃冰箱保存0、5、10、20d后，按“1.2.3項(xiàng)”處理，進(jìn)行樣品的色譜測(cè)定。含量變化的RSD為8.95%，表明嗎啡在血漿中至少放置20d穩(wěn)定。

2.5 患者血樣含量測(cè)定 取患者上肢靜脈血5mL，離心分取血漿，按“2.2項(xiàng)”平行處理3份，避光低溫保存至測(cè)定。RPHPLC法測(cè)定血漿中嗎啡的含量，重現(xiàn)性比較好，結(jié)果見表2。

表2 患者血樣的測(cè)定結(jié)果（n＝3，ng/mL）

3 討 論

嗎啡為兩性物質(zhì)，調(diào)整pH值至中性可顯著改變峰形，提高靈敏度。嗎啡在波長(zhǎng)212nm和233nm處均有較大吸收，但在212nm處掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)基線穩(wěn)定性差且內(nèi)源性物質(zhì)干擾較大，故選擇233nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

樣品預(yù)處理是檢測(cè)的關(guān)鍵步驟之一，國(guó)外報(bào)道嗎啡的提取多為固相萃取法［1－3］，雖然固相萃取能排除內(nèi)源性雜質(zhì)峰的干擾，但成本較高，國(guó)內(nèi)尚未普遍應(yīng)用，本文參考文獻(xiàn)［4－6］，采用有機(jī)溶劑提取法，提取時(shí)損失較小，回收率達(dá)到89%以上，提取量與嗎啡的濃度之間線性關(guān)系良好，而且操作簡(jiǎn)便、快速，適合大樣本的檢測(cè)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外測(cè)定人體內(nèi)嗎啡含量的方法主要有液質(zhì)聯(lián)譜法（LC－MS－MS）［7－8］、氣質(zhì)聯(lián)譜法（GC－MS）［9］、超高效液相色譜法（SPE－UPLC）［10］、電泳法［11］、化學(xué)發(fā)光分析法［12］、反相離子對(duì)高效液相色譜法［13］等，這些方法不同程度地存在分析儀器普及率低、樣品前處理復(fù)雜、特異性差、分析時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，并不適合基層臨床研究的推廣。本文建立的RP－HPLC法與陳利琴等［14］報(bào)道相比，選用了較長(zhǎng)的分離色譜柱，在較低流速的情況下實(shí)現(xiàn)了很好的分離，有效保護(hù)了色譜柱及高壓泵系統(tǒng)的使用壽命，利于樣品大批量連續(xù)分析?？傊?，該方法既避開了體內(nèi)代謝產(chǎn)物的干擾，又可使保留時(shí)間適中，減少了工作量。具有前處理簡(jiǎn)單、分析儀器普及率高、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于嗎啡的臨床研究和不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

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Rapid monitoring of morphine in plasma by RP－HPLC＊

HuangHongyong1，ZhiXiaoyan1，ZhangRuiling1△，ShiTianyuan1，2
（1.TheSecondAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity，Xinxiang，Henan453002，China；2.KeyLaboratoryofHenanProvincialBiologicalPsychiatry，Xinxiang，Henan453002，China）

ObjectiveTo establish determination of morphine in plasma by RP－HPLC.MethodsColumn was Diamonsil?C18（250×4.6mm，5μm）；Mobile phase was MeOH：Buffer（80∶20，V/V），the flow rate was 1.3mL/min；UV wavelength was 233 nm.ResultsWithin a concentration range of 1.8－921.6ng/mL，the standard curve of Morphine was C＝0.962 7F－0.019 6and had a good linearity（r＝0.999 7，n＝8）.The lower limit of quantitation was 1.8ng/mL.ConclusionIt appears to be a rapid，convenient，sensitive and reproducible method for clinical research and adverse reaction monitor of Morphine.

rapid monitoring；morphine；RP－HPLC

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.23.018

A

1671－8348（2012）23－2392－02

河南省教育廳計(jì)劃項(xiàng)目（2010B320012）；2010年河南省衛(wèi)生廳衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程（3052）?！?通訊作者，Tel：（0373）3373798；E－mail：zhangruilingxx＠163.com。

2011－10－02

2012－02－16）