3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化過程中G蛋白偶聯(lián)受體48的表達(dá)研究

孫海燕 彭永德 董維平 王煜非 范能光 劉瑞 趙立 丁曉穎

肥胖是由脂肪細(xì)胞的數(shù)量增多和體積增大所致，而脂肪細(xì)胞的增多是由于前脂肪細(xì)胞不斷分化所引起，近年來脂肪細(xì)胞的分化調(diào)控已成為肥胖及其相關(guān)疾病的研究熱點(diǎn)。

前期研究結(jié)果提示G蛋白偶聯(lián)受體48（G protein coupled receptor 48，GPR48）基因敲除小鼠脂肪組織含量明顯減少，但該受體參與脂肪細(xì)胞的增殖與分化機(jī)制不明[1]。過氧化物酶體增殖體激活受體g2（peroxisome proliferatoractivated receptorγ2，PPARg2）和 CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT Enhancer binding protein CEBP α，C/EBPα）是調(diào)節(jié)脂肪形成的主要轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細(xì)胞分化中起著決定性作用[2-4]。因此探討GPR48與核轉(zhuǎn)錄因子在脂肪細(xì)胞分化過程的表達(dá)及調(diào)控關(guān)系具有重要意義。

本研究觀察前體脂肪細(xì)胞分化過程中GPR48、PPARγ2和C/EBPα的表達(dá)水平變化，探討GPR48參與脂肪細(xì)胞分化過程及其與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制的關(guān)系。

材料與方法

一、材料

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T3-L1）株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。高糖Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)，地塞米松和1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）（美國Sigma公司），合成人胰島素（美國禮來公司），逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（美國promega公司），SYBR Green PCR master mix(日本Takara公司 )，Trizol(美國Invitrogen公司)，熒光定量PCR儀器(美國Bio-Rad公司)。

二、方法

（一）3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)

將3T3-L1細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板，在含10﹪胎牛血清和1﹪青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液37℃、5﹪CO2培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合，加細(xì)胞分化誘導(dǎo)A液（0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 μg/ml胰島素），繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，更換培養(yǎng)液，加誘導(dǎo)B液（10 μg/ml胰島素）培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)液，以后每2 d更換培養(yǎng)液，分別在誘導(dǎo)前0 d和誘導(dǎo)后2、3、6、10和14 d收集細(xì)胞。

（二）總核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)提取和Real-time PCR

按照Trizol說明提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量，取2 μg RNA加入隨機(jī)引物，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在熒光定量PCR儀器上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μl，SYBR Green Master 10 μl，上 下 游 引 物（2.5 Μm）各 2 μl，用DEPC-H2O補(bǔ)足至20 μl體積。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min預(yù)變性，95℃15 s、60℃1 min，循環(huán)40次。融解曲線顯示為單峰。應(yīng)用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)3孔重復(fù)（N = 3，n= 3）。引物由上海博尚生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。受體表達(dá)水平以±s表示。不同時間表達(dá)水平比較采用隨機(jī)區(qū)組F檢驗(yàn)。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化前后形態(tài)變化

體外培養(yǎng)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞在分化前呈梭形，無脂滴纖維母樣細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)分化的第3～4天細(xì)胞變大變圓，部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，隨著分化時間的延長細(xì)胞內(nèi)脂滴富集，到誘導(dǎo)分化的1周左右，80﹪細(xì)胞呈成熟脂肪細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈圓形，胞漿中富含脂滴，圍繞核周呈戒環(huán)樣結(jié)構(gòu)。（圖1，2）

二、3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中GPR48、PPARγ2和C/EBPα的表達(dá)水平變化

圖1 誘導(dǎo)分化前3T3-L1前脂肪細(xì)胞?(×100)

圖2 誘導(dǎo)分化1周脂肪細(xì)胞?(×100)

比較前體脂肪細(xì)胞不同分化階段GPR48表達(dá)水平變化，比較脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ2和C/EBPα表達(dá)水平變化。由圖3可知，與誘導(dǎo)前期相比，GPR48基因在誘導(dǎo)分化第2天表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 4.12，P= 0.015)，分化第3天仍較高表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 6.21，P= 0.003)。分化第6天至第14天下調(diào)，與分化前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4結(jié)果顯示，PPARγ2表達(dá)在誘導(dǎo)分化后明顯上調(diào)，分化第6天達(dá)高峰，第10～14天持續(xù)處于較高水平，各時段表達(dá)水平與誘導(dǎo)前期相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值在4.17～22.65間，P均 < 0.01)。圖5結(jié)果顯示，C/EBPα表達(dá)在誘導(dǎo)分化后明顯上調(diào)，分化后第3天達(dá)高峰，第6～10天持續(xù)保持在較高水平，與誘導(dǎo)前期相比各時段表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值在4.38～13.87間，P均< 0.01)，第14天趨于下調(diào)，與分化前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖3 3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中GPR48表達(dá)

圖4 3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中PPARγ2表達(dá)

圖5 3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中C/EBPα表達(dá)

討 論

肥胖是冠心病、高血壓、2型糖尿病及高脂血癥等許多嚴(yán)重疾病的共同致病基礎(chǔ)。肥胖的形成主要包括2個方面，脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加和脂肪細(xì)胞體積增大。脂肪細(xì)胞分化是決定脂肪細(xì)胞體積數(shù)量的關(guān)鍵因素，脂肪分化調(diào)控也是研究肥胖及其相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)制的熱點(diǎn)問題。3T3-L1前體脂肪細(xì)胞通過經(jīng)典雞尾酒誘導(dǎo)方案可以分化為脂肪細(xì)胞，是目前體外研究脂肪細(xì)胞分化應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞系。PPARγ和C/EBPα是調(diào)節(jié)脂肪形成最主要的轉(zhuǎn)錄因子，它們調(diào)控著許多中間型轉(zhuǎn)錄因子[2-4]。

表2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中PR48、PPARγ、C/EBPα的表達(dá)水平變化（±s）

表2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中PR48、PPARγ、C/EBPα的表達(dá)水平變化（±s）

注：與誘導(dǎo)前比較aP < 0.05

mRNA相對表達(dá) 誘導(dǎo)前 誘導(dǎo)第2天 誘導(dǎo)第3天 誘導(dǎo)第6天 誘導(dǎo)第10天 誘導(dǎo)第14天 F值 P值GPR48 1.01 ± 0.14 2.91 ± 0.78a 2.39 ± 0.36a 1.09 ± 0.28 1.28 ± 0.15 1.05 ± 0.23 13.2340.000 PPARγ 1.02 ± 0.2227.95 ± 2.32a265.11 ± 109.69a916.76 ± 79.23a233.00 ± 17.73a671.98 ± 67.31a104.3400.000 C/EBPα 1.00 ± 0.0658.21 ± 16.85a172.36 ± 21.39a 78.00 ± 14.36a 37.11 ± 2.78a 15.34 ± 21.39 48.2850.000

盡管PPARg2和C/EBPα對脂肪細(xì)胞分化的重要性已得到廣泛認(rèn)可，然而二者如何調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制仍知之甚少。本研究數(shù)據(jù)顯示PPARγ2和C/EBPα的表達(dá)在誘導(dǎo)分化后明顯上調(diào)，以后持續(xù)保持在較高水平并趨于穩(wěn)定。二者的表達(dá)與脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)積聚過程相一致。

GPR48是近年發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體家族中功能未知的孤兒受體，屬于糖蛋白激素受體。近期對GPR48敲除小鼠研究均發(fā)現(xiàn)純合敲除小鼠體型消瘦，腹腔網(wǎng)膜和性腺旁白色脂肪發(fā)育不良，脂肪組織含量明顯減少，并伴有生育缺陷和圍生期死亡[1,5]。GPR48在體內(nèi)分布廣泛，白色脂肪、棕色脂肪、肝臟、肌肉、性腺和腎上腺均有高豐度表達(dá)，這些組織對于機(jī)體的脂肪代謝和能量平衡意義重大。GPR48在脂肪組織高豐度表達(dá)，跨膜蛋白GPR48是否通過核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2參與脂肪細(xì)胞的增殖與分化機(jī)制，本研究數(shù)據(jù)提供了跨膜蛋白GPR48和轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2、C/EBPα基因在脂肪細(xì)胞分化不同時期的表達(dá)，GPR48表達(dá)高峰出現(xiàn)于分化初期，早于轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2、C/EBPα的表達(dá)高峰，GPR48可能在分化早期階段參與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化。

1 Li XY, Lu Y, Sun HY, et al. G protein-coupled receptor 48 upregulates estrogen receptor α expression via cAMP/PKA signaling in the male reproductive tract[J]. Development,2010, 137(1):151-157.

2 Odegaard JI, Ricardo-Gonzalez RR, Goforth MH, et al.Macrophage-specific PPARgamma controls alternative activation and improves insulin resistance[J]. Nature, 2007,447(7148):1116-1120.

3 Bai P, Houten SM, Huber A, et al. Peroxisome proliferatoractivated Receptor (PPAR)-2 controls adipocyte differentiation and adipose tissue function through the regulation of the activity of the retinoid X receptor/PPAR{gamma} heterodimer[J]. J Biol Chem, 2007,282(52):37738-37746.

4 Zuo Y, Qiang L, Farmer SR. Activation of CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) alpha expression by C/EBP beta during adipogenesis requires a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-associated repression of HDAC1 at the C/ebp alpha gene promoter [J].J Biol Chem, 2006, 281(12):7960-7967.

5 Tzameli I, Fang H, Ollero M, et al. Regulated production of a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligand during an early phase of adipocyte differentiation in 3T3-L1 adipocytes [J]. J Biol Chem, 2004, 279(34):36093-36102.

6 Mazerbourg S, Bouley D, Sudo S, et al. Leucine-rich repeat-containing, G protein-coupled receptor 48 null mice exhibit intrauterine growth retardation associated with embryonic and perinatal lethality[J]. Mol Endocrinol,2004, 18(9):2241-2254.