腎移植受者單抗原磁珠法檢測人類白細胞抗原DP抗體

邱建新 蔡俊超 Paul I. Terasaki

以往用MAILA法檢測孕婦血清中的人類白細胞抗原DP（human leucocyte antigen-DP，HLADP）抗體，發(fā)現(xiàn)陽性率為9.7﹪，并與HLA-Ⅰ類、Ⅱ類抗原的反應(yīng)高度相關(guān)[1]。用同樣的方法，有7.3﹪等待腎移植的患者中也檢測到HLA-DP抗體[2]。由于常常和其他HLA抗體連在一起，用常規(guī)的方法檢測出HLA-DP抗體較為困難。目前最新的技術(shù)是將HLA-DP抗原包被到可用流式細胞儀檢測的磁珠上，使HLA-DP抗體能與其他HLA抗體很清楚的區(qū)別并檢測出來[3]。應(yīng)用流式細胞檢測方法，Young等已發(fā)現(xiàn)有12﹪等待移植的患者中可檢測到HLA-DP抗體，45﹪的再次移植患者和13﹪非移植女性患者都有HLADP抗體，表明移植和懷孕可引起HLA-DP抗原的致敏。

對象與方法

一、對象

本研究323例被檢患者中，有功能組138例，排斥組185例，來自以下4移植中心：（1）?Bignon JD，法國，南特，HLA和組織相容性實驗室；（2）?Lee PC，臺灣成功大學(xué)醫(yī)學(xué)院?移植外科；（3）?Rosenberg JC，美國，密歇根移植協(xié)會；（4）?Miller J，美國，邁阿密大學(xué)醫(yī)學(xué)院，外科移植部。

二、檢測方法

HLA-Ⅰ類抗體檢測系采用One Lambda公司的試劑，按照其操作手冊用LABScreen PRA法檢測，流式細胞單抗原磁珠檢測按試劑盒操作說明進行，可檢測HLA-DR、DQ和DP抗體。HLA-DP抗體的檢測采用HLA-Ⅱ類4組流式磁 珠，包 括 DPw1(DP0101)、DPw2(DP0201)、DPw3(DP0301)、DPw4(DP0401)、DPw5(DP0501)和DPw11(DP1101)6種DP抗原。

取 5 μl?流式細胞單抗原磁珠與?20 μl?未稀釋的血清培養(yǎng)?30 min，洗滌后加入100 μl經(jīng)100倍稀釋的熒光抗人體IgG（1:100稀釋）培養(yǎng)30 min，經(jīng)洗滌和固定后用流式細胞儀檢測。使磁珠主要分布于 FSC vs SSC區(qū)域，同時通過標(biāo)準的磁珠確定FL2 vs FL1的區(qū)域范圍。磁珠是通過流式細胞儀的FL2頻道來識別的，HLA?抗體的陽性反應(yīng)的熒光強度是通過FL1頻道來識別的。陰性窗口是通過陰性對照血清的FL2 vs FL1的區(qū)域范圍來確定的，這個窗口是用來判斷被檢血清結(jié)果的[4]，如果檢測出的磁珠位移到陰性窗口限定區(qū)域外則判定為陽性（圖1）。

圖1 DP0301抗體陽性的流式細胞結(jié)果，箭頭即陽性抗體

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，各類抗體的例數(shù)以相對數(shù)表示，功能組與排斥組抗體例數(shù)組間的差異檢驗采用卡方檢驗，以P< 0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

在138例有功能組的腎移植患者血清中5.1﹪檢測到HLA-DP抗體，而排斥組的185例患者血清中有 19.5﹪檢測到?DP?抗體（c2=14.176，P= 0.000，表1)。在138例有功能組患者中，12.3﹪和8.7﹪的患者有HLA-Ⅰ類和DR/DQ抗體，而排斥組中有39.5﹪和48.6﹪的患者有同樣的抗體（c2=28.966，P= 0.000；c2=58.393，P= 0.000）。

表1 有功能組與排斥組 HLA-DP 抗體陽性患者比較

HLA-Ⅰ類和DR/DQ抗體與DP抗體的關(guān)系如表2所示，HLA-DP抗體在排斥組與DR/DQ抗體的關(guān)系更為密切?？傮w來說，在有功能組和排斥組中分別有42.9﹪（3/7）和63.9﹪（23/36）的HLA-DP陽性患者有DR/DQ抗體。在HLA-Ⅰ類和DR/DQ都陰性的患者中，在有功能組和排斥組分別有3.5﹪和13﹪的患者有DP抗體（P< 0.05）。

與HLA-Ⅰ類抗體和DR/DQ抗體一樣，比起有功能組來，排斥組能檢測到更多的HLA-DP抗體。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)即使在HLA-Ⅰ類和DR/DQ抗體都陰性的患者中，排斥組的HLADP抗體仍比有功能組明顯要高，提示HLA-DP抗體可不依賴其他HLA抗體而獨立產(chǎn)生。

討 論

最近，Nelson等[5]報告了 4例 HLA-DR、DQ零錯配（3例同時HLA-A、B、C零錯配）的患者由HLA-DP抗體引起的體液性排斥反應(yīng)，這些患者移植前供體B細胞的流式交叉配型均為陽性，雖然其中2例經(jīng)治療后逆轉(zhuǎn)，但移植腎的生存率還是受到明顯影響，得出結(jié)論HLA-DP抗體和急性血管性排斥反應(yīng)明顯有關(guān)，即使在A、B、DR零錯配的患者中，B細胞交叉發(fā)應(yīng)陽性也應(yīng)引起重視。

當(dāng)?shù)?次移植物被排斥掉后HLA-DP抗體的增加，可以解釋HLA-DP位點的錯配而造成的。而對再次移植，首次移植后所產(chǎn)生HLA-DP抗體會攻擊再次移植物[6]。由于絕大部分受體和供體并不作DP配型，如果能很好地作HLA-DP抗原的組織配型，有HLA-DP抗原的供體移植給有HLA-DP抗體的受體是可以避免的。由于陽性的B細胞交叉配型并不一定導(dǎo)致超急性排斥反應(yīng)，所以常常被忽略[7]。應(yīng)用更為敏感的B細胞交叉配型方法，雖然可能出現(xiàn)檢測背景過高的問題，但仍可提高HLA-DP抗體檢出率。HLA-DP抗體可出現(xiàn)于已排斥掉一個移植物的再次移植，也提示對于再次移植，避免陽性的B細胞交叉配型是非常重要的。HLA-DP抗原按其結(jié)構(gòu)來說屬于HLA-Ⅱ類抗原，但它并不是與腎移植配型的抗原（DR和DQ）緊密相連的[8]，所以即使在A、B、DR均相配的患者中也可出現(xiàn)HLA-DP錯配，因此即使都是零錯配的移植也應(yīng)列出HLA-DP的抗體。

雖然HLA-DP抗原有超過100個的等位基因，本研究用的6個等位基因幾乎涵蓋了美國[9]和法國人群[10]的70﹪～80﹪。在這些等位基因中，最多見的是DP0301，其次是DP0501和DP0401（圖2）。從抗原的分布頻率來說，美國[9]和法國[10]的人群分布應(yīng)該能檢測到更多的DP0401，而非DP0301，說明了DP0301具有更強的抗原性。所以本研究得出結(jié)論：在一個移植腎被排斥掉以后，能產(chǎn)生很多的HLA-DP抗體，因此對于再次移植，應(yīng)作DP的組織配型以避免DP等位基因致敏的存在。

圖2 ?HLA-DP抗體的頻率分布

表2 HLA-DP?抗體和?HLA-Ⅰ類及?DR/DQ?抗體的關(guān)系

1 Mueller-Eckhardt G, Kiefel V, Tlusty A, et al.Incidence and specificity of HLA-DP antibodies in pregnancy sera[J].Hum Immunol,1990,29(3):166-174.

2 Pfeiffer K, Vogeler U, Albrecht KH, et al. HLA-DP antibodies in patients awaiting renal transplantation[J].Transpl Int,1995,8(3):180-184.

3 Pei R, Lee JH, Shih NJ,et al. Single human leukocyte antigen flow cytometry beads for accurate identification of human leukocyte antigen antibody specificities[J].Transplantation,2003,75(1): 43-49.

4 Arnold ML, Pei R, Spriewald B, et al. Anti-HLA class II antibodies in kidney retransplant patients[J]. Tissue Antigens,2005,65(4): 370-378.

5 Nelson KA, Youngs D, Marks MH, et al. Acute humoral rejection is associated with antibodies to HLA-DP (Abstract)[J]. Am J Transplant, 2005,5(Suppl 11): 245.

6 Mytilineos J, Deufel A, Opelz G. Clinical relevance of HLA-DPB locus matching for cadaver kidney retransplants:a report of the collaborative transplant study[J]. Transplantation, 1997, 63(9):1351-1354.

7 Le Bas-Bernardet S, Hourmant M, Valentin N, et al.Identification of the antibodies involved in B-cell crossmatch positivity in renal transplantation[J].Transplantation, 2003,75(4): 477-482.

8 Baisch JM, Capra JD. Linkage disequilibrium within the HLA complex does not extend into HLA-DP[J]. Scand J Immunol,1993, 37(4): 499-503.

9 Hsia S. Population studies: Caucasian US normal. In:Terasaki PI, Gjertson DW eds. HLA 1997. Los Angeles,CA: UCLA Tissue Typing Laboratory, 1997: 336.

10 Begovich A. HLA-DPA1, -DPB1, -DQA1 and DQB1 allele frequencies in a population from France (CEPH)[J]. Hum Immunol, 2004,65(9-10):935.