聯(lián)合應(yīng)用共刺激通路阻斷劑誘導(dǎo)小鼠記憶性心臟移植耐受的研究

解百宜 陳繼冰 夏俊杰 王永志 梁華 齊忠權(quán)

在臨床器官移植中，移植受者由于初次移植、輸血、懷孕以及持續(xù)暴露于共生性病原微生物[1-2]等多種原因，外周血中有40﹪～ 50﹪的T細(xì)胞有記憶性的表型，對移植物初次及再次移植的存活時間造成重大影響[3-4]。目前認(rèn)為同種反應(yīng)性記憶性T細(xì)胞(memory T cell，Tm)在此過程中發(fā)揮核心作用，主要包括CD4+和CD8+Tm兩大類。Tm是免疫系統(tǒng)中抵御外來病原體的重要組成部分，然而在器官移植中卻成為重要的障礙，甚至可以在移植術(shù)后馬上攻擊、損傷移植物[5-7]。由于Tm的激活對共刺激通路及Th1型細(xì)胞因子的依賴較低，故傳統(tǒng)的阻斷效應(yīng)性T細(xì)胞激活的方法療效很差，所以如何阻止Tm參與排斥反應(yīng)成為研究熱點。結(jié)合CD4+和CD8+Tm激活分別依賴于OX40/OX40L及LFA-1/ICAM-1的特點[8-9]，本研究擬先阻斷Tm激活再誘導(dǎo)移植物耐受，來探索誘導(dǎo)記憶性移植耐受的新方法。

材料與方法

一、實驗動物

C57BL/6(H-2b)和BALB/c(H-2d)小鼠，雌性，8～12 周齡，體質(zhì)量 (20 ± 2)?g，購自中科院上海斯萊克實驗動物有限公司。

二、注射及熒光抗體

CTLA4Ig、Anti-CD40L(MR-1)、Anti-LFA1(M17/4)和Anti-OX40L(RM134L)單克隆抗體及其同型對照抗體，購自黎巴嫩Bioexpress公司。流式細(xì)胞學(xué)檢測用PE anti-CD44和FITC anti-CD62L及其同型對照抗體，購自美國Biolegend公司，流式細(xì)胞儀為德國Partec公司生產(chǎn)Cyflow Space型。

三、皮膚預(yù)致敏模型及脾臟T細(xì)胞提取

以BALB/c小鼠為供體，C57BL/6小鼠為受體進(jìn)行背部全層皮膚移植(皮片為圓形，直徑>1.2 cm)。皮膚移植4周后，取受體鼠脾臟，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后過尼龍毛柱(Wako，日本)，分離出T細(xì)胞。

四、記憶性心臟移植模型

將2×106個預(yù)致敏BALB/c小鼠脾臟T細(xì)胞從尾靜脈過繼轉(zhuǎn)移給未處理C57BL/6小鼠，第2天以BALB/c小鼠為供體，采用套管法進(jìn)行頸部異位的心臟移植[10]，構(gòu)建記憶性心臟移植模型。分別在移植第0、2、4和6天從腹腔給予共刺激通路阻斷劑的治療，包括anti-LFA1(0.1 mg)、CTLA 4 Ig(0.25 mg)、anti-CD40L(0.25 mg) 及anti-OX 40L(0.25 mg)，對照組注射多種同型對照，二聯(lián)用藥組聯(lián)合應(yīng)用CTLA4Ig和anti-CD40L，四聯(lián)用藥組聯(lián)合應(yīng)用CTLA4Ig、anti-CD40L、anti-LFA-1和anti-OX40L。移植術(shù)后由頸部搏動情況判斷移植物是否存活，搏動停止即判斷為完全排斥。

五、移植心臟的病理學(xué)檢測

于移植術(shù)后第10天取移植物心底部分，用10﹪甲醛溶液固定，做石蠟切片(5 μm)后進(jìn)行H&E染色，光鏡下觀察。器官排斥程度參照ISHLT標(biāo)準(zhǔn)[11-12]進(jìn)行判定，并進(jìn)行組間的比較。

六、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)

取各組小鼠脾臟T細(xì)胞。然后取BALB/c小鼠的脾臟，制成脾細(xì)胞懸液后用40 g/ml的絲裂霉素處理。將上述兩種細(xì)胞按供體：受體=1:10的比例進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，培養(yǎng)?3 d，每只鼠平行做三復(fù)孔，通過BrdU法(Chemicon，美國)對各組增殖程度進(jìn)行測定。

七、實時定量?RT-PCR(qRT-PCR)

取各組移植物標(biāo)本的心尖部分提取RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR得到cDNA樣本。之后取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(每個樣本三復(fù)孔，每孔2 μL)，用實時定量PCR對其進(jìn)行分析(ABI stepone系統(tǒng)，西班牙Biosystems公司)。以Syber Green I和-actin為參照，檢測各組移植物中 IL-2、IFN-、IL-10和Foxp3基因的表達(dá)量。引物序列如下：-actin forward 5’-CATCCGTAAA ACCTCTATGCCAAC-3’，and reverse 5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’；IFN-forward 5’-CGGCACAGTCATTGAAAGCCTA-3’,and reverse 5’-GTTGCTGATGGCCTGATTGTC-3’；IL-2 forward 5’-GGAGCAGCTGTTGATGGACCTAC-3’,and reverse 5’-AATCCAGAACATGCCGCAGAG-3’；IL-10 forward 5’-GACCAGCTGGACAACATACTGCTAA-3’；and reverse 5’-GATAAGGCTTGGCAACCCAAGTAA-3’；Foxp3 forward 5’-CAGCTCTGCTGGCGAAAGTG-3’；and reverse 5’-TCGTCTGAAGGCAGAGTCAGGA-3’。

八、統(tǒng)計學(xué)分析

采用 GraphPad Prism??(GraphPad，Inc，CA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。生存期分析使用Kaplan-Meier法。MLR及realtime-PCR檢測結(jié)果組間比較采用t檢驗，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、皮膚預(yù)致敏模型中Tm含量檢測

本研究為了檢測同種異體皮膚預(yù)致敏誘導(dǎo)Tm產(chǎn)生的能力，分離皮膚移植4周的B6小鼠脾臟T細(xì)胞，用PE-anti-CD44和FITC-anti-CD62L單抗標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)未處理的小鼠脾臟中Tm占6.52﹪(圖1a)，而預(yù)致敏小鼠為26.5﹪(圖1b)，表明皮膚預(yù)致敏可以誘導(dǎo)受者鼠體內(nèi)分化出大量具有記憶性表型的T細(xì)胞。

二、記憶性模型中移植物生存期比較

為了誘導(dǎo)記憶性心臟移植耐受，本研究聯(lián)合應(yīng)用多種共刺激通路阻斷劑進(jìn)行干預(yù)，分別為CTLA4Ig+anti-CD40L(二聯(lián)用藥)組、CTLA 4 Ig+anti-CD40L+anti-LFA 1+anti-OX 40L(四聯(lián)用藥)組及對照組（各組n= 6），發(fā)現(xiàn)對照組平均存活5.17 d，二聯(lián)用藥組平均存活10.33 d，四聯(lián)用藥組均> 100 d。只有四聯(lián)用藥組可誘導(dǎo)移植物長期耐受(圖2)。

圖1 未處理小鼠與皮膚移植4周的小鼠脾臟T細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測

圖2 記憶性模型中移植物生存期比較（n = 6）

三、記憶性心臟移植耐受機(jī)制的研究

為了研究四聯(lián)用藥組誘導(dǎo)記憶性心臟移植耐受的機(jī)制，本研究重新構(gòu)建記憶性心臟移植模型，各組用抗體治療10 d后處死。取移植物心底部分，對比各組移植物排斥等級；心尖部分用于檢測各組排斥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平；取脾臟并提取T細(xì)胞，一部分用來檢測Tm表達(dá)水平，剩余部分通過MLR檢測各組細(xì)胞免疫水平的差別。

（一）各組移植物排斥等級評分

參照ISHLT標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，對照組均為4級(圖3a，b)，二聯(lián)用藥組為 3B 級 (圖3c，d)，四聯(lián)用藥組為0級(圖3e，f )。說明四聯(lián)用藥組可完全阻止移植物的淋巴細(xì)胞浸潤，二聯(lián)用藥組和對照組則發(fā)生嚴(yán)重的移植排斥反應(yīng)。

圖3 各組移植物排斥等級評分

（二）各組脾臟中Tm表達(dá)水平

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，只有對照組出現(xiàn)CD44高表達(dá)峰(圖4)，說明對照組有Tm持續(xù)浸潤，而治療組Tm表達(dá)缺失。

圖4 各組脾臟中Tm表達(dá)水平

（三）各組細(xì)胞免疫水平比較

從MLR結(jié)果可以看出，對照組與二聯(lián)用藥組的吸光度均> 0.6，明顯高于四聯(lián)用藥組(吸光度 < 0.4，t= 5.045，P= 0.001，表1)，說明二聯(lián)用藥組基本上對記憶性移植排斥反應(yīng)無效，而四聯(lián)用藥則可明顯減弱了受體鼠記憶性免疫應(yīng)答(圖5)。

表1 脾細(xì)胞混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的增值程度

圖5 各組細(xì)胞免疫水平比較

（四）各組移植物中排斥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平

通過qRT-PCR檢測，相對于對照組，二聯(lián)用藥組的IL-2、IFN-γ和Foxp3基因的相對表達(dá)量較低，并且四聯(lián)用藥組比二聯(lián)用藥組更低(圖6a,b,c)；四聯(lián)用藥組IL-10表達(dá)水平明顯高于其它兩組(圖6d)。說明相對于對照組而言，二聯(lián)用藥組降低了移植物中細(xì)胞免疫的水平，但未誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)；而四聯(lián)用藥組在降低移植物中細(xì)胞免疫水平的同時，未能誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)，但可誘導(dǎo)了大量IL-10分泌性Tr1細(xì)胞的表達(dá)。

討 論

開發(fā)共刺激通路阻斷劑是臨床誘導(dǎo)移植物供者特異性耐受的重要研究方向，其中CTLA4Ig已完成人源化，并進(jìn)入三期臨床試驗階段。這一類藥物屬于生物制劑，具有作用位點準(zhǔn)確、效果明顯和副作用小的特點。聯(lián)合應(yīng)用CTLA4Ig、anti-CD40L兩種藥物雖然可誘導(dǎo)初次移植心臟和胰島等耐受[13-14]，但對記憶性移植排斥模型無治療效果，這主要是由于兩類細(xì)胞的存在，即不依賴于CD4+T細(xì)胞的同種異體反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞[15-16]和Tm[17]，而前者即為受者體內(nèi)CD8+Tm的主要來源。在最近幾年的研究中，人們發(fā)現(xiàn)某些共刺激通路阻斷劑可以起到特異性阻斷的效果，例如anti-LFA-1可以抑制同種反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的激活及增殖[18-20]，anti-OX40L可以通過阻斷DC與Tm間的OX40L/OX40途徑，抑制CD4+Tm的激活[21-22]。本研究則是在此基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用上述四種共刺激通路阻斷劑，研究其抗排斥治療的效果，將皮膚移植4周小鼠脾臟的T細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移到同系小鼠體內(nèi)后進(jìn)行心臟移植，借此建立記憶性同種異體排斥模型，并分組給予不同的治療方式。通過對各組移植物生存期和病理學(xué)的觀察分析(圖2，3)，發(fā)現(xiàn)四聯(lián)用藥可明顯地對抗記憶性移植排斥，取得理想的治療效果。

圖6 各組移植物中相關(guān)基因表達(dá)水平

Tm形成后會歸巢到二級淋巴組織，包括效應(yīng)性Tm和中樞性Tm兩種，分別主要存在于脾臟和引流淋巴結(jié)中。兩種Tm在同種異體記憶性排斥中都可發(fā)揮重要作用，且效應(yīng)性Tm的作用更強(qiáng)[23]。為了研究四聯(lián)用藥的對抗記憶性移植排斥機(jī)制，檢測了各組的脾臟和移植物。在治療試驗中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移10 d后對照組脾臟存在大量的Tm，說明Tm注射到體內(nèi)后會首先歸巢到脾臟并有一定程度的自體增殖。而用藥組脾臟Tm表達(dá)明顯減少(圖4)，這很可能是由于過繼轉(zhuǎn)移的Tm無法被激活或激活后效應(yīng)受到抑制而凋亡所致。由于Tm細(xì)胞只需要TCR信號(但有MHC限制性)即可以激活，故應(yīng)用anti-OX40L和anti-LFA1試圖分別阻止CD4+和CD8+Tm細(xì)胞的增殖和分化，該想法在脾細(xì)胞MLR(圖5)和移植物中IL-2和IFN-γ表達(dá)水平檢測(圖6 A,B)時得到驗證，充分說明四聯(lián)用藥強(qiáng)大的抑制同種反應(yīng)性Tm的效果，使Tm在體內(nèi)(不論在脾臟還是在移植物中)處于克隆無能或AICD(activation induced cell death)狀態(tài)。

單純聯(lián)合應(yīng)用CTLA4Ig和anti-CD40L可誘導(dǎo)初次心臟移植的耐受，是由于在移植物局部可誘導(dǎo)形成大量的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[24]。2006年Ito等[25-26]報道OX40L/OX40途徑的激活會通過分泌IFN-γ而抑制IL-10分泌性Tr1細(xì)胞的形成，還有抑制Foxp3+T細(xì)胞功能的作用。結(jié)合上述研究成果，檢測移植物中Foxp3和IL-10的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)四聯(lián)用藥組的移植物局部Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)并未增加(圖6C)，但Tr1細(xì)胞的表達(dá)水平卻明顯增加(圖6D)，說明在記憶性排斥模型中誘導(dǎo)耐受的機(jī)制與初次移植不同，是以大量誘導(dǎo)?Tr1細(xì)胞為主，這也解釋了為什么在某些特殊體質(zhì)的移植受者(如初次移植、輸血和懷孕以及特殊感染)單純阻斷效應(yīng)性T細(xì)胞而無法誘導(dǎo)有效耐受了[27-29]。

綜上所述，聯(lián)合四種共刺激通路阻斷劑可以在抑制移植物Th1型細(xì)胞因子表達(dá)的同時誘導(dǎo)大量Tr1細(xì)胞表達(dá)，并以此削弱Tm誘導(dǎo)的機(jī)體細(xì)胞免疫水平，清除體內(nèi)的Tm，從而達(dá)到延長記憶性同種異體心臟移植生存期、降低排斥反應(yīng)的效果。2008年Minamimura等[30]報道阻斷效應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答的同時聯(lián)合使用清除性anti-CD 122，清除CD8+CD122+Tm治療序貫?zāi)Ｐ椭械钠つw移植，取得長期耐受的效果，也可能是一種有前景的抑制記憶性移植排斥的方法；另外我們發(fā)現(xiàn)再次移植受者體內(nèi)還存在另一個重要的破壞移植物耐受形成的因素，就是記憶性體液免疫應(yīng)答[31]，集中反應(yīng)在序貫?zāi)Ｐ椭行呐K移植物的存活時間更短(2 d之內(nèi))，目前有一些可能有效的作用靶點被發(fā)現(xiàn)，如記憶性B細(xì)胞高表達(dá)CD44、CD27等，有待于進(jìn)一步的探索與驗證。

1 Burrows SR, Khanna R, Burrows JM, et al. An alloresponse in humans is dominated by cytotoxic T lymphocytes (CTL) cross-reactive with a single Epstein-Barr virus CTL epitope: implications for graft-versus-host disease[M]. J Exp Med, 1994, 179(4):1155-1161.

2 Burrows SR, Silins SL, Khanna R, et al. Cross-reactive memory T cells for Epstein-Barr virus augment the alloresponse to common human leukocyte antigens:degenerate recognition of major histocompatibility complex-bound peptide by T cells and its role in alloreactivity[J]. Eur J Immunol, 1997, 27(7):1726-1736.

3 Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection[J]. Nature, 1998, 396(6712):690-695.

4 McFarland RD, Douek DC, Koup RA, et al. Identification of a human recent thymic emigrant phenotype[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(8):4215-4220.

5 Valujskikh A, Li XC. Frontiers in nephrology:T cell memory as a barrier to transplant tolerance[J]. J Am Soc Nephrol, 2007, 18(8):2252-2261.

6 Bingaman AW, Farber DL. Memory T cells in transplantation: generation, function, and potential role in rejection[J]. Am J Transplant, 2004, 4(6):846-852.

7 Lakkis FG, Sayegh MH. Memory T cells: a hurdle to immunologic tolerance[J]. J Am Soc Nephrol, 2003,14(9):2402-2410.

8 Maxwell JR, Weinberg A, Prell RA, et al. Danger and OX40 receptor signaling synergize to enhance memory T cell survival by inhibiting peripheral deletion[J]. J Immunol, 2000, 164(1): 107-112.

9 Ni HT, Deeths MJ, Li W, et al. Signaling pathways activated by leukocyte function-associated Ag-1-dependent costimulation[J]. J Immunol, 1999, 162(9):5183-5189.

10 Matsuura A, Abe T, Yasuura K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique[J].Transplantation, 1991, 51(4):896-898.

11 Billingham ME, Cary NR, Hammond ME, et al. A working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of heart and lung rejection: Heart Rejection Study Group. The International Society for Heart Transplantation[J]. J Heart Transplant, 1990, 9(6):587-593.

12 Winters GL, Marboe CC, Billingham ME. The International Society for Heart and Lung Transplantation grading system for heart transplant biopsy specimens:clarification and commentary[J]. J Heart Lung Transplant,1998, 17(8):754-760.

13 Corbascio M, Ekstrand H, Osterholm C, et al. CTLA4Ig combined with anti-LFA-1 prolongs cardiac allograft survival indefinitely[J]. Transpl Immunol, 2002, 10(1):55-61.

14 Corbascio M, Mahanty H, Osterholm C, et al. Antilymphocyte function-associated antigen-1 monoclonal antibody inhibits CD40 ligand-independent immune responses and prevents chronic vasculopathy in CD40 ligand-deficient mice[J]. Transplantation, 2002,74(1):35-41.

15 Trambley J, Bingaman AW, Lin A, et al. Asialo GM1(+)CD8(+) T cells play a critical role in costimulation blockade-resistant allograft rejection[J]. J Clin Invest,1999, 104(12):1715-1722.

16 Williams MA, Trambley J, Ha J, et al. Genetic characterization of strain differences in the ability to mediate CD40/CD28-independent rejection of skin allografts[J]. J Immunol, 2000, 165(12): 6849-6857.

17 Vu MD, Clarkson MR, Yagita H, et al. Critical, but conditional, role of OX40 in memory T cell-mediated rejection[J]. J Immunol, 2006, 176(3):1394-1401.

18 Oderup C, Malm H, Ekberg H, et al. Costimulation blockade-induced cardiac allograft tolerance: inhibition of T cell expansion and accumulation of intragraft CD4(+)Foxp3(+) T cells[J]. Transplantation, 2006,82(11): 1493-1500.

19 Malm H, Pahlman C, Veress B, et al. Combined costimulation blockade prevents rejection of allogeneic islets in mice[J]. Scand J Immunol, 2006, 64(4):398-403.

20 Richards DM, Zhang N, Dalheimer SL, et al. Allopeptidespecific CD4(+) T cells facilitate the differentiation of directly alloreactive graft-infiltrating CD8(+) T Cells[J].Am J Transplant, 2007, 7(10):2269-2278.

21 Demirci G, Amanullah F, Kewalaramani R, et al.Critical role of OX40 in CD28 and CD154-independent rejection[J]. J Immunol, 2004, 172(3):1691-1698.

22 Yuan X, Salama AD, Dong V, et al. The role of the CD134-CD134 ligand costimulatory pathway in alloimmune responses in vivo[J]. J Immunol, 2003, 170(6): 2949-2955.

23 Oberbarnscheidt MH, Ng YH, Chalasani G. The roles of CD8 central and effector memory T-cell subsets in allograft rejection[J]. Am J Transplant, 2008, 8(9):1809-1818.

24 Wekerle T, Kurtz J, Bigenzahn S, et al. Mechanisms of transplant tolerance induction using costimulatory blockade[J]. Curr Opin Immunol, 2002, 14(5):592-600.

25 Ito T, Wang YH, Duramad O, et al. OX40 ligand shuts down IL-10-producing regulatory T cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(35):13138-13143.

26 Vu MD, Xiao X, Gao W, et al. OX40 costimulation turns off Foxp3+Tregs[J]. Blood, 2007, 110(7):2501-2510.

27 Cecka JM. Living donor transplants[J]. Clin Transpl,1995:363-377.

28 Kupiec-Weglinski JW. Graft rejection in sensitized recipients[J]. Ann Transplant, 1996, 1(1): 34-40.

29 Baid S, Saidman SL, Tolkoff-Rubin N, et al. Managing the highly sensitized transplant recipient and B cell tolerance[J]. Curr Opin Immunol, 2001, 13(5):577-581.

30 Minamimura K, Sato K, Yagita H, et al. Strategies to induce marked prolongation of secondary skin allograft survival in alloantigen-primed mice[J]. Am J Transplant,2008, 8(4): 761-772.

31 Sanz I, Wei C, Lee FE, et al. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells[J]. Semin Immunol, 2008, 20(1):67-82.