HLAMatchmaker軟件分析Eplets的配型在臨床腎移植配型中的應(yīng)用*

張 行，潘曉東，徐慧英，吳存造，蔡 勇，夏 鵬，鄭少玲，楊亦榮，陳必成，△

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室，2.移植中心，浙江溫州325000）

HLA（human leukocyte antigen）是人類(lèi)最復(fù)雜的基因多態(tài)性系統(tǒng)，同種異體移植術(shù)前需進(jìn)行供受者間HLA配型。HLA抗原零錯(cuò)配能獲得較高的移植成功率和較長(zhǎng)的術(shù)后生存期，但是回顧性研究中發(fā)現(xiàn)某些存在多個(gè)HLA抗原錯(cuò)配的移植亦能取得較好的效果［1］。因各 HLA間存在交叉反應(yīng)組抗原（CREGs），具有相同或相似的抗原決定簇結(jié)構(gòu)或氨基酸殘基，組內(nèi)有較好的匹配，但也可產(chǎn)生此組抗供者抗體的交叉反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上的CREGs配型策略，認(rèn)為可接受性錯(cuò)配抗原（permissible mismatched antigen）為零錯(cuò)配，擴(kuò)大了可接受的供體選擇。但CREGs的缺點(diǎn)是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)，不能進(jìn)行精確的評(píng)估可接受錯(cuò)配和不可接受的錯(cuò)配。

HLAMatchmaker（Duquesnoy教授基于微軟公司的 Excel軟件開(kāi)發(fā)，http：／／www.hlamatchmaker.net／）軟件可以通過(guò)計(jì)算機(jī)比對(duì)HLA的接受程度，它基于分子免疫學(xué)的以下兩個(gè)原理：（1）每一個(gè)HLA分子是由一系列能各自產(chǎn)生特異性抗體的Eplets（決定抗原決定簇特異性的關(guān)鍵氨基酸組成，指位于HLA分子表面3.0～3.5埃（1埃 ＝1×10-8cm）大小的空間多態(tài)性位點(diǎn)）；（2）移植受者不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)自身HLA Eplets的抗體。為此設(shè)計(jì)的HLAMatchmaker可計(jì)算供受者間HLA氨基酸序列Eplets的差異，能夠定量地分析出Eplets錯(cuò)配數(shù)，給出不兼容的錯(cuò)配位點(diǎn)，找到可接受的錯(cuò)配（acceptable mismatch）從而尋找合適的供者，提高移植術(shù)后受者的生存率［2］。運(yùn)用此軟件分析可避開(kāi)基因錯(cuò)配位點(diǎn)，讓群體反應(yīng)性抗體高敏感性受者亦能接受移植［3］。本研究中我們回顧性對(duì)239例移植受者運(yùn)用3種現(xiàn)有配型方法即HLA六抗原無(wú)錯(cuò)配配型、交叉反應(yīng)組配型和基于HLAMatchmaker軟件的Eplets配型，分析 Eplets配型優(yōu)越性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2011年1月份至2012年12月份期間在溫州醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院移植中心進(jìn)行239例腎移植的受者，其中男性 169例（70.7%），女性 70例（29.3%），最大年齡 70，最小年齡17歲，平均年齡（45.23±11.70）歲，O型103例，A型 66例，B型 48例，AB型22例，供者共139例。移植供受者的ABO血型匹配。PRA（panel reactive antibody）≥10%陽(yáng)性病人17例（7.11%）。

1.2 HLA檢測(cè)方法

采用美國(guó) One Lambda公司的 Micro SSP HLA Class and ABDR DNA Typing Tray通過(guò)低分辨率的順序特異引物聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction with sequence-specific primers，PCR-SSP）方法檢測(cè)出HLA的配型，用 HLAMatchmaker中的（4-digit Convert）將血清學(xué)的HLA轉(zhuǎn)化成基因型的HLA，另外有部分標(biāo)本采用GenDX公司Sanger法基因測(cè)序試劑盒檢測(cè)HLA的基因型。

1.3 配型方法

1.3.1 HLA配型 采用美國(guó)器官分配聯(lián)合網(wǎng)（United Network for Organ Sharing，UNOS）在 1990年制定的HLA六抗原無(wú)錯(cuò)配標(biāo)準(zhǔn)（Zero HLA-A，B，DR Antigen Mismatch，0 Ag Mismatch）：供受者HLA存在一個(gè)抗原錯(cuò)配得一分，抗原錯(cuò)配數(shù)累積，分值在0～6之間，分?jǐn)?shù)越低匹配度越高。

1.3.2 CREGs配型 Thompson提出的 HLA氨基酸殘基配型，又稱(chēng)交叉反應(yīng)組配型（HLA-cross reactive groups matching，CREGs）［4］。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)行了得分累積的改進(jìn)：供受者HLA六抗原位點(diǎn)完全匹配為0，不匹配但如屬于同一交叉反應(yīng)組則得分為0.5，此外的不匹配為1分，分值在0～6之間，分?jǐn)?shù)越低匹配度越高。

1.3.3 HLAmatchmaker軟件配型 供受者 HLA-Ⅰ基因型使用（ABC Matching for 500 donor-recipient pairs）和 HLA-Ⅱ基因型（DRDQMatching for 500 donorrecipient pairs），HLAmatchmaker軟件對(duì) HLA-Ⅰ 和HLA-Ⅱ分別進(jìn)行配對(duì)，尋找出錯(cuò)配數(shù)及錯(cuò)配Eplets，在Eplets表達(dá)式中，如66 RNM代表一個(gè)天冬氨酸，在氨基酸序列第66位用字母N表示，而相鄰的第65位精氨酸和第67位蛋氨酸分別用字母R和M表示。如果前后的氨基酸同中間的氨基酸相同，則表達(dá)式中不再重復(fù)顯示，如9F代表氨基酸序列第9位的苯丙氨酸，62QE代表氨基酸序列第62位的甘氨酸和第63位為谷氨酸。然后在通過(guò)EXCEL合計(jì)錯(cuò)配數(shù)，分?jǐn)?shù)越低匹配度越高［5］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

三種方法分組人數(shù)之間比較采用多分類(lèi)列表概率分布檢驗(yàn)計(jì)算，三種方法所得錯(cuò)配數(shù)通過(guò)兩兩比較采用秩轉(zhuǎn)換結(jié)合隨機(jī)取組設(shè)計(jì)的方差分析檢驗(yàn)計(jì)算。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所有統(tǒng)計(jì)均由SPSS 16.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 HLAMatchmaker結(jié)果顯示形式

在HLAMatchmaker軟件中輸入相對(duì)應(yīng)的供受者的基因型，HLAMatchmaker軟件會(huì)自動(dòng)分析供受者之間Eplets錯(cuò)配的數(shù)量和位點(diǎn)。如：受者的HLA-Ⅰ的基因型為 A*0301、A*3001、B*1302、B*2705，而供者 HLA-Ⅰ的基因型 A*0201、A*3001、B*1302，根據(jù)軟件分析結(jié)果顯示，共計(jì)存在11個(gè)Eplets錯(cuò)配，而這些錯(cuò)配分別用不同位點(diǎn)的氨基酸表示62GE65RKA70AHS116Y127K142MT144TKH151HV207 S184A193AV。另外運(yùn)用相同的方法獲得該供受者HLA-ⅡEplets的錯(cuò)配（表 1）。

2.2 三種方法錯(cuò)配數(shù)得分

239例腎移植的三種配型方法所獲得的錯(cuò)配情況，其中6例在表2中列出，如Case 3中傳統(tǒng)的HLA抗原配型組顯示HLA-Ⅰ、Ⅱ分別為3分和2分，合計(jì)為5分；在CREGs配型組中，HLA-Ⅰ、Ⅱ分別存在2分和 1.5分，合計(jì) 3.5分；HLAMatchmaker軟件配型的結(jié)果顯示，HLA-Ⅰ、Ⅱ均為18分，合計(jì)36分。三種方法計(jì)算的239例供受者配型計(jì)錯(cuò)配數(shù)得分，秩轉(zhuǎn)換并經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)計(jì)算，顯示 HLAMatchmaker軟件配型的方法與傳統(tǒng)HLA配型、CREG交叉反應(yīng)抗原組配型有顯著性的差異（表2，P＜0.01）。

2.3 三種配型方法的分布

HLA對(duì)239供受者HLA-Ⅰ、Ⅱ抗原配型所得分?jǐn)?shù)，根據(jù)HLA抗原錯(cuò)配結(jié)果將受者分為7組，分別：0個(gè) Mismatch（MM）組 1例；1個(gè) MM組 2例；2個(gè)MM組16例；3個(gè)MM組31例；4個(gè)MM組81例；5個(gè)MM組72例；6個(gè)MM組36例。

CREGs對(duì)239供受者HLA-Ⅰ、Ⅱ抗原配型所得分?jǐn)?shù)，0個(gè)MM組1例；0＜n≤1個(gè)MM組4例；1＜n≤2個(gè)MM組為27例；2＜n≤3個(gè)MM組為73例；3＜n≤4個(gè)MM組為89；4＜n≤5個(gè)MM組為39例；5＜n≤6個(gè)MM組為6例（表3）。

HLAMatchmaker對(duì)239供受者 HLA-Ⅰ、Ⅱ抗原配型所得分?jǐn)?shù)，根據(jù) Valentini［6］建立了一套相對(duì)完善的標(biāo)準(zhǔn)，0個(gè) Eplets Mismatch（EMM）組1例；0＜n≤10個(gè)EMM組10例；10＜n≤20個(gè) EMM組43例；20＜n≤30個(gè) EMM組73例；30＜n≤40個(gè)EMM組66例；50＜n個(gè)EMM組8例（表3）。

Tab.1 Examples of donor-recipients HLA-Ⅰ mismatch with HLAMatchmaker at the Eplets level

Tab.2 Examples of donor-recipients HLA the number of mismatch with three methods

Tab.3 Results of HLA matching，CREGmatching and HLAMatchmaker typing matching in grouping

根據(jù)表3的結(jié)果將 HLA、CREGs和 HLAMatchmaker三種方法所得分?jǐn)?shù)結(jié)果按照3個(gè)組別進(jìn)行分組，分別為低錯(cuò)配組、中錯(cuò)配組和高錯(cuò)配組（圖1）。在低錯(cuò)配組中，HLA、CREG和 HLAMatchmaker分別為 19（7.9%）、32（13.4%）、54（22.6%）；中錯(cuò)配組中分別為 112（46.9%）、162（67.7%）、139（58.1%）；高錯(cuò)配組中，分別為 108（45.2%）、45（18.8%）、46（19.2%）。從結(jié)果上分析，三種方法存在顯著差異（χ2＝66.68 P＜0.01），HLAMatchmaker配型方法相比較其他兩種方法在0～2低錯(cuò)配組別的人數(shù)較明顯的增加，而3～4中錯(cuò)配組別HLAMatchmaker配型方法的人數(shù)介于傳統(tǒng)HLA和CREGs兩種配型方式之間，5～6高錯(cuò)配的高錯(cuò)配組別 HLAMatchmaker人數(shù)與CREGs方法人數(shù)相近，且這兩種方法的人數(shù)明顯少于傳統(tǒng)的HLA配型方法。從表4中可以看出，HLAMatchmaker相對(duì)于其他兩種方法可以明顯提高供受者的相配率。

Tab.4 Comparison among three methods of HLA matching group in 239 donor-recipients

Fig.1 Number of recipients gruoping by low-high MM

3 討論

器官移植中，不管?chē)?guó)際或者國(guó)內(nèi)均普遍采用HLA六抗原無(wú)錯(cuò)配為標(biāo)準(zhǔn)的配型，但由于HLA在基因上的高度多態(tài)性及復(fù)雜的蛋白空間結(jié)構(gòu)，供受者間存在HLA-Ⅰ、Ⅱ抗原零錯(cuò)配的概率很低，致使患者需等待較長(zhǎng)時(shí)間才得以移植手術(shù)。但是隨著移植免疫學(xué)的發(fā)展，提出了CREGs的配型方法，是指特異性血清學(xué)反應(yīng)格局的公共抗原為同一組零錯(cuò)配，該方法通過(guò)HLA抗原分子公共抗原表位在一定程度上提高了HLA無(wú)錯(cuò)配和低錯(cuò)配的幾率，并且在之前的研究中顯示出了較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，CREGs抗原相合的腎移植術(shù)后效果要優(yōu)于CREGs抗原不相合的［7］。但是CREGs同樣存在缺陷，亦無(wú)法精確地預(yù)測(cè)HLA分子的立體化學(xué)空間結(jié)構(gòu)和氨基酸序列間的差異，依然將配型停留在抗原水平，而現(xiàn)在的HLA分型則大多開(kāi)始采用分子生物學(xué)的技術(shù)，如PCR和測(cè)序等，使得HLA分型的準(zhǔn)確性和精確度都得到了較大的提高。而根據(jù)CREGs的這種配型方式已無(wú)法滿(mǎn)足HLA基因型多樣性和對(duì)新基因型的配型需求。此外，生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，使蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模擬的技術(shù)更加成熟，但是一直缺乏一種能在空間立體結(jié)構(gòu)層面比較HLA分子的配型方法，為此Duquesnoy教授引入了Eplets這樣全新的概念并開(kāi)發(fā)出HLAmatchmaker軟件以解決此問(wèn)題。而我們?cè)诖塑浖幕A(chǔ)上，首次將該軟件應(yīng)用于臨床中腎移植手術(shù)前的配型和對(duì)移植術(shù)后的抗體預(yù)判。

HLAMatchmaker軟件配型的方法則是基于E-plets位點(diǎn)間的比對(duì)，給出不兼容的錯(cuò)配。本研究將本中心兩年間的239例次腎移植受者，按照傳統(tǒng)HLA配型、CREGs配型和基于HLAMatchmaker軟件配型進(jìn)行比較，HLAmatchmaker配型方法的低錯(cuò)配人數(shù)明顯少于其他兩種方法，并有顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明 HLAMatchmaker能明顯提高相配率。同時(shí)HLAMatchmaker軟件能在抗原結(jié)構(gòu)相容性上更精確地發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配，即HLA抗原型相同，也可能存在個(gè)別Eplets的不同；但其優(yōu)勢(shì)是在供受者HLA分型不同時(shí)對(duì)比Eplets組合找到最少的錯(cuò)配。由于個(gè)體攜帶的Eplets庫(kù)差異，即使供、受者HLA 6抗原型完全不相同，亦有找到低錯(cuò)配的可能；此外，在傳統(tǒng)HLA配型和 CREGs配型認(rèn)為較好的配率，但是 HLAMatchmaker卻能篩選出較多存在的錯(cuò)配Eplets，反之亦然。從結(jié)果中顯示三種方法的錯(cuò)配存在著明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。采用 HLAMatchmaker軟件的配型方法不但擴(kuò)大了供體選擇的范圍同時(shí)也更容易找到優(yōu)質(zhì)供者。

在以往的研究中運(yùn)用HLAMatchmaker軟件進(jìn)行Eplets配型可顯著降低腎移植術(shù)后的致敏性。Duquesnoy教授回顧性研究了1987～1999年間美國(guó)器官分配和聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)（UNOS）和歐洲器官庫(kù)（Eurotransplant）數(shù)據(jù)中的HLA-DR抗原零錯(cuò)配的腎移植情況下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎移植受者HLA-A、B在0～4個(gè)E-plet錯(cuò)配的情況下5年移植物生存率為（76.30±3.11）%，而傳統(tǒng) HLA-A、B抗原零錯(cuò)配的生存率為76.8%，兩者未顯示出差異，說(shuō)明了即使存在少數(shù)的EMM的情況下同HLA-A、B抗原零錯(cuò)配長(zhǎng)期生存率基本一致，而且此結(jié)果在不同膚色種族及是否為高致敏受者并不受影響。同時(shí)HLAMatchmaker的配型方式能夠顯著降低腎移植術(shù)后的致敏性，改善移植物的存活率［2，8］。此外亦能根據(jù)每個(gè)受者那些EMM（Eplets mismatch）位點(diǎn)再次通過(guò) HLAMatchmaker系列的軟件進(jìn)行直接分析得出受者移植術(shù)后預(yù)判具體HLA特異性抗體及其產(chǎn)生的幾率［9，10］。以上均顯示了HLAMatchmaker軟件在移植配型有非常突出的優(yōu)勢(shì)和廣泛應(yīng)用的潛力。

使用HLAMatchmakers軟件來(lái)進(jìn)行配型，不但可以處理供者和大量潛在受者之間的配型，提高工作效率。同時(shí)該方法擴(kuò)大了移植受者的可接受群體，有機(jī)會(huì)考慮影響移植結(jié)果的其他因素。由于完全基于計(jì)算機(jī)的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)，避免了傳統(tǒng)HLA配型和使用CREGs配型容易造成的人為誤配。HLA配型是決定移植腎和受者存活的重要因素，應(yīng)用 HLAMatchmaker軟件配型的方法，能夠有效提高受者和腎的存活率，同時(shí)降低腎移植后急性排除的發(fā)生率。良好的配型可減少免疫抑制劑的用藥量，有效避免藥物濃度過(guò)高引起的毒性反應(yīng)，也節(jié)省了費(fèi)用。在T細(xì)胞免疫可被控制的移植時(shí)代，HLAMatchmaker軟件配型符合精確、高效的要求，并對(duì)避免和分析體液免疫提供了全新的工具。

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