大孔樹脂分離純化杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的研究

馬 龍，周先漢，許 暉

（1.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠 233030；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

大孔樹脂分離純化杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的研究

馬 龍1，周先漢2，許 暉1

（1.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠 233030；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

為獲得較高純度的桃葉珊瑚甙，采用大孔樹脂吸附法對(duì)杜仲翅果中桃葉珊瑚甙粗提液進(jìn)行純化研究。比較5種大孔吸附樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的靜態(tài)吸附-解吸效果，從中篩選出適合桃葉珊瑚甙分離純化的樹脂，并對(duì)其動(dòng)態(tài)吸附和解吸性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明：D4020樹脂最適合桃葉珊瑚甙的純化；當(dāng)上樣液濃度為3mg/mL、pH7、上樣速率2mL/min、上樣液體積40mL時(shí)，樹脂達(dá)到動(dòng)態(tài)吸附飽和；再用120mL 50%（v/v）乙醇溶液，以2mL/min的流速可以洗脫完全。經(jīng)過D4020樹脂的純化，桃葉珊瑚甙精制品純度達(dá)到62.54%。

大孔樹脂，吸附，純化，杜仲翅果，桃葉珊瑚甙

杜仲（Eucomm ia ulmoides Oilv.）多年生落葉喬木植物，被稱為“神奇之樹”，其神奇之處在于杜仲葉、花、果實(shí)同杜仲皮一樣都含有人體必不可少的藥用活性成分，具有十分獨(dú)特的醫(yī)療保健功能[1]。桃葉珊瑚甙（aucubin）是杜仲中一種含量豐富的生物活性成分，分布于杜仲各部位，研究表明其在杜仲果實(shí)中含量最高[2]。桃葉珊瑚甙為環(huán)烯醚萜甙類化合物，具有護(hù)肝解毒、消炎、抗氧化、抗衰老、抗骨質(zhì)疏松及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞等眾多藥理活性[3-4]。大孔吸附樹脂是一類不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑且有較好吸附性能的有機(jī)高聚物吸附劑，大孔樹脂吸附分離技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的一種新型分離純化技術(shù)，具有吸附容量大、吸附速度快、分離效果好、再生簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物天然活性成分（如皂苷、黃酮、內(nèi)酯、生物堿等）的分離和純化[5]。本研究以大孔樹脂吸附法對(duì)杜仲翅果中桃葉珊瑚甙粗提物的純化進(jìn)行探討，旨在為杜仲翅果資源的深度開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲翅果 購(gòu)自陜西省略陽(yáng)縣杜仲開發(fā)中心；桃葉珊瑚甙對(duì)照品 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自SIGMA公司；Epstahl試劑（對(duì)二甲氨基苯甲醛0.25g，冰醋酸50g，35%磷酸5g，水20m L）、鹽酸、氫氧化鈉等 均為市售，分析純；大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠，種類和技術(shù)參數(shù)見表1。

AR1140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；752紫外可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；20×280mm樹脂柱 安徽天長(zhǎng)市千秋玻璃儀器廠；BT1－100恒流泵 上海琪特分析儀器有限公司；CT/DW 60E冷凍干燥機(jī) Heto－Holten公司；ACQUITY UPLC－LCT超高效液相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 PremierTM XEWaters公司。

表1 大孔樹脂的技術(shù)參數(shù)Table 1 Characteristic parameter of themacroporous adsorption resin

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大孔樹脂預(yù)處理 依照廠家說明書及相關(guān)文獻(xiàn)[6]進(jìn)行處理。

1.2.2 上樣液制備 稱取10g杜仲翅果干粉（石油醚脫脂脫膠處理，60℃烘干至恒重）置于圓底燒瓶中，加入120m L 72%（v/v）乙醇溶液，在超聲波萃取器中以300W功率提取21m in，抽濾，減壓濃縮，加水轉(zhuǎn)溶，以4000r/m in轉(zhuǎn)速離心10m in去除雜質(zhì)，上清液即為上樣液。

1.2.3 靜態(tài)吸附－解吸實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 稱取經(jīng)預(yù)處理并吸干表面水分的不同型號(hào)濕樹脂2g置于磨口錐形瓶中，精密加入過量已知濃度的桃葉珊瑚甙提取液，搖勻，密封，于4℃冰箱中放置24h[7]，進(jìn)行吸附，吸取上清液，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算出各型號(hào)樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的最大吸附容量，計(jì)算公式如下：

式中，C0為吸附前提取液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C1吸附平衡時(shí)提取液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；V1為提取液體積（m L）；W為濕樹脂質(zhì)量（g）。

1.2.3.2 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 分別將上述充分吸附了桃葉珊瑚甙的樹脂進(jìn)行過濾，再各加入70%（v/v）的乙醇溶液50m L，密封，于4℃冰箱中放置24h，進(jìn)行解吸，吸取解吸液，測(cè)定桃葉珊瑚甙的濃度，計(jì)算出各型號(hào)樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的解吸率，計(jì)算公式如下：

式中，C0為吸附前提取液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C1吸附平衡時(shí)提取液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C2解析后解析液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；V1為提取液體積（m L）；V2為解吸液體積（m L）。

1.2.4 動(dòng)態(tài)吸附－解吸實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 量取經(jīng)預(yù)處理樹脂20m L濕法裝柱，吸取濃度4.57mg/m L的桃葉珊瑚甙粗提液上樣，pH為5.3（原液pH），以2m L/m in的流速通過樹脂柱，分部收集流出液（每管收集1BV），測(cè)定其中桃葉珊瑚甙濃度，繪制泄漏曲線，確定上樣液用量。

濕法裝柱，吸取5份40m L濃度4.57mg/m L的桃葉珊瑚甙粗提液，分別稀釋至0.5、1、2、3、4mg/m L上樣，pH為5.3（原液pH），流速2m L/min，用80m L蒸餾水水洗，混合液定容至250m L，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算吸附率，考察不同上樣液濃度對(duì)吸附效果的影響。

濕法裝柱，吸取5份60m L濃度3mg/m L的桃葉珊瑚甙粗提液，pH為5.3（原液pH），分別以流速1、2、3、4、5m L/m in上樣，用80m L蒸餾水水洗，混合液定容至250m L，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算吸附率，考察不同上樣速率對(duì)吸附效果的影響。

濕法裝柱，吸取5份60m L濃度3mg/m L的桃葉珊瑚甙粗提液，分別調(diào)節(jié)pH至3、4、5、6、7、8上樣，流速2m L/m in，用80m L蒸餾水水洗，混合液定容至250m L，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算吸附率，考察不同上樣液pH對(duì)吸附效果的影響。

式中，C1－上樣液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C2－混合液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；V1－為上樣液體積（m L）；V2－為混合液體積（m L）。

1.2.4.2 動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 取按最佳動(dòng)態(tài)吸附條件吸附的樹脂柱，用70%（v/v）的乙醇溶液以流速2m L/m in洗脫，分部收集洗脫液（每管收集1BV），測(cè)定其中桃葉珊瑚甙濃度，繪制洗脫曲線，確定洗脫劑液體用量。

取完成吸附的樹脂柱，用濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%（v/v）的乙醇溶液各120m L以流速2m L/m in洗脫，洗脫液定容至250m L，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算洗脫率，考察不同洗脫劑濃度對(duì)解吸效果的影響。

取完成吸附的樹脂柱，用50%（v/v）的乙醇溶液120m L分別以流速1、2、3、4、5m L/m in洗脫，洗脫液定容至250m L，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算洗脫率，考察不同洗脫速率對(duì)解吸效果的影響。

式中，C1－上樣液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C2－混合液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C3－洗脫液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；V1－為上樣液體積（m L）；V2－為混合液體積（m L）；V3－為洗脫液體積（m L）。

1.2.5 桃葉珊瑚甙含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[8]采用“對(duì)二甲氨基苯甲醛法”。

1.2.6 桃葉珊瑚甙定性分析 使用超高效液相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀以桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品（SIGMA公司）定性。

1.2.6.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（100×2.1mm，1.7μm）；檢測(cè)器：質(zhì)譜檢測(cè)器；流動(dòng)相：乙腈∶水（10mmol/L乙酸銨+0.1%氨水）= 10∶90；柱溫：40℃；樣品室溫度：10℃；流速：0.3m L/m in；進(jìn)樣體積：1μL。

1.2.6.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；掃描方式：負(fù)離子V模式；掃描范圍：m/z100～1000；毛細(xì)管電壓：2500kV；錐孔電壓：10V；毛細(xì)管溫度：350℃；源溫度：110℃；干燥氣流速：600L/h；輔助氣流速：40L/h。

1.2.7 精制品純度計(jì)算 洗脫液旋蒸濃縮后冷凍干燥至恒重得桃葉珊瑚甙精制品，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量（m1）樣品，用適量甲醇溶解定容后按1.2.5方法測(cè)定桃葉珊瑚甙含量（m2），計(jì)算樣品純度：

純度（%）=m1/m2×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的靜態(tài)吸附和解吸效果

要取得較好的分離純化效果，必須正確有效地選用樹脂。從表2可以看出，相同條件下NKA-9、AB-8、DM 130、NKA、D4020等五種大孔樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙都有一定的吸附能力，其中NKA的最大吸附容量最大，但其解吸率較低，最終獲得的桃葉珊瑚甙較少；D4020的最大吸附容量雖然不是最大的，但是其解吸率很高，最終獲得的桃葉珊瑚甙最多。因此D4020對(duì)桃葉珊瑚甙具有良好的吸附與解吸能力，故確定D4020為桃葉珊瑚甙的分離純化樹脂。

表2 樹脂篩選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Table 2 Results of resin choice test

2.2 大孔樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的動(dòng)態(tài)吸附效果

2.2.1 泄漏曲線結(jié)果 由圖1可知，隨上樣液用量的增加，流出液中桃葉珊瑚甙濃度逐漸增加，當(dāng)上樣液用量在2BV時(shí)，流出液中桃葉珊瑚甙濃度接近上樣液濃度的1/10，即達(dá)到泄漏點(diǎn)，當(dāng)上樣液用量達(dá)到7BV時(shí)，流出液中桃葉珊瑚甙濃度已接近上樣液濃度并不再增加，說明此時(shí)樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的吸附已接近飽和。故濃度4.57mg/m L的上樣液取2BV即40m L上樣為宜。

圖1 吸附泄漏曲線Fig.1 The curve of adsorption leak

2.2.2 上樣液濃度對(duì)吸附效果的影響 由圖2可知，隨著上樣液濃度的提高，樹脂吸附率逐漸升高，在達(dá)到3mg/m L后又略有下降。當(dāng)濃度較高時(shí)，大孔樹脂的吸附容量增加，但同時(shí)泄漏較多，造成了產(chǎn)品的浪費(fèi)。故選擇上樣液濃度為3mg/m L，此濃度下上樣液用量為60m L。

2.2.3 上樣速率對(duì)吸附效果的影響 由圖3可知，上樣速率越低，樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的吸附效果越好，吸附率越高，這是因?yàn)榱魉龠^快，部分產(chǎn)品與樹脂的接觸時(shí)間較短，來(lái)不及被樹脂吸附便隨上樣液一同流出樹脂柱。上樣速率從2m L/min到1m L/min吸附率升高趨勢(shì)不明顯，雖然較低流速可以提高吸附率，但同時(shí)也會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，故綜合考慮吸附率和生產(chǎn)周期，選擇上樣速率為2m L/m in。

圖2 上樣液濃度對(duì)吸附率的影響Fig.2 Effectof sample concentration on adsorption percent

圖3 上樣速率對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effectof velocity on adsorption percent

2.2.4 上樣液pH對(duì)吸附效果影響 由圖4可知，在中性環(huán)境中樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的吸附率最大，酸性環(huán)境和堿性環(huán)境都使得樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的吸附率急劇下降。這是由于桃葉珊瑚甙為一種糖苷，在酸性和堿性環(huán)境下均容易發(fā)生水解和結(jié)構(gòu)的變化，其水解產(chǎn)物苷元具有縮醛結(jié)構(gòu)，性質(zhì)非常活潑，容易進(jìn)一步分解或聚合，使其在溶液中的濃度降低，從而影響大孔吸附樹脂的吸附[7]。故選擇上樣液pH為7。

圖4 pH對(duì)吸附率的影響Fig.4 Effectof pH on adsorption percent

2.3 大孔樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的動(dòng)態(tài)解吸效果

2.3.1 洗脫劑用量的確定 由圖5可知，隨著洗脫劑乙醇溶液用量的增加，桃葉珊瑚甙不斷從樹脂中洗脫下來(lái)。當(dāng)洗脫劑的用量為6BV時(shí)，洗脫液中已基本不存在桃葉珊瑚甙。故從經(jīng)濟(jì)成本和操作時(shí)間考慮，選擇6BV即120m L為洗脫劑用量。

2.3.2 洗脫劑濃度對(duì)洗脫效果的影響 由圖6可知，洗脫劑濃度對(duì)樹脂洗脫率的影響很大，根據(jù)“相似相溶”原理，不同濃度的乙醇溶液其極性不同，影響桃葉珊瑚甙與樹脂之間的吸附作用使桃葉珊瑚甙從樹脂上分離下來(lái)。根據(jù)圖6所示，50%（v/v）的乙醇溶液的洗脫率最大，故選擇洗脫劑乙醇的濃度為50%（v/v）。

2.3.3 洗脫速率對(duì)洗脫效果的影響 由圖7可知，洗脫速率越慢，桃葉珊瑚甙的洗脫效果越好，洗脫率越高；洗脫速率快不利于桃葉珊瑚甙的洗脫，因?yàn)橄疵搫┎荒艹浞峙c被吸附的桃葉珊瑚甙發(fā)生作用而將其從樹脂上洗脫出來(lái)。但是洗脫速率過低，將導(dǎo)致整個(gè)生產(chǎn)周期的延長(zhǎng)，生產(chǎn)效率下降，綜合考慮生產(chǎn)效率和產(chǎn)品產(chǎn)量，選擇洗脫速率為2m L/m in。

圖5 洗脫曲線Fig.5 The curve of elution

圖6 洗脫劑濃度對(duì)洗脫率的影響Fig.6 Effectof eluent concentration on desorption percent

圖7 洗脫速率對(duì)洗脫率的影響Fig.7 Effectofmoving velocity on desorption percent

2.4 定性分析結(jié)果

針對(duì)桃葉珊瑚甙的分子量將345.11的[M-H]-分子離子峰在質(zhì)譜總離子流圖中提取出來(lái)得到桃葉珊瑚甙精制品和桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品的LC-MS譜圖，見圖8、圖9。桃葉珊瑚甙精制品為D4020型大孔吸附樹脂在上述最佳動(dòng)態(tài)吸附-解吸條件下獲得洗脫液減壓濃縮并經(jīng)凍干得到。保留時(shí)間tR=1.03m in的峰即為桃葉珊瑚甙。

2.5 純度檢測(cè)結(jié)果

桃葉珊瑚甙粗提液經(jīng)D4020樹脂純化后，測(cè)得精制品純度為62.54%，較純化前的純度19.71%有了較大的提高，說明D4020樹脂對(duì)桃葉珊瑚甙的純化效果較好，能大幅度提高提取物中的桃葉珊瑚甙含量。

圖8 桃葉珊瑚甙精制品LC-MS譜圖Fig.8 LC-MS chromatogram for refined sample

圖9 桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品LC-MS譜圖Fig.9 LC-MS chromatogram for standard substance

3 結(jié)論

D4020樹脂為最佳的分離純化杜仲翅果桃葉珊瑚甙的樹脂，其靜態(tài)最大飽和吸附量為25.25mg/m L，靜態(tài)解吸率為83.11%。D4020樹脂分離純化桃葉珊瑚甙的最佳工藝條件為：上樣液濃度3mg/m L、上樣液pH為7、上樣速率2m L/min、洗脫劑選用50%（v/v）的乙醇溶液、用量120m L、洗脫速率2m L/m in。按照這一最佳工藝條件分離純化，桃葉珊瑚甙精制品純度由原來(lái)的19.71%提高到62.54%，取得了較好的效果。

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Study on separation and purification process of aucubin from Eucomm ia seeds by macroporous resins

MA Long1，ZHOU Xian-han2，XU Hui1
（1.Department of Biology and Food Engineering，Bengbu College，Bengbu 233030，China；2.Institute of Biology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei230009，China）

In order to obtain aucubin w ith high purity from Eucomm ia seeds，macroporous resin was used for purification.The adsorp tion and desorp tion rates of 5 types of macroporous resins towards aucubin were investigated.Among the mac roporous resins，D4020 resin was the most suitab le to purify aucubin.When 40m L of 3mg/m L and pH 7 sam p le was flowed through D4020 resin column at a speed of 2m L/m in，the adsorp tion reached dynam ic equilibrium.The adsorbed aucubin could be com p letely eluted w ith 120m L of 50%（v/v）ethanolat2m L/m in.The purity of aucubin could be 62.54%by refinement of the D4020 resin.

macroporous resin；adsorp tion；purification；Eucomm ia seeds；aucubin

TS201.1

B

1002-0306（2012）09-0249-04

2011－08－01

馬龍（1979-），男，碩士，講師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。

安徽省高等學(xué)校省級(jí)食品科學(xué)與工程特色專業(yè)建設(shè)點(diǎn)資助項(xiàng)目（20101091）；安徽省食品科學(xué)與工程教學(xué)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（20101094）。