越橘粗提物體外抑菌活性及穩(wěn)定性的研究

陳 沙，羅秋水，張鳳英

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045）

越橘粗提物體外抑菌活性及穩(wěn)定性的研究

陳 沙，羅秋水，張鳳英*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045）

研究了兩種越橘（野生藍莓和紅豆越橘）粗提物的抑菌作用及穩(wěn)定性。方法：采用牛津杯法探討越橘果粗提物對6種食源性致病菌和1種食品中常見腐敗菌的抑菌作用及溫度、pH、紫外線等因素對抑菌穩(wěn)定性的影響。結(jié)果：越橘對金黃色葡萄球菌等7種細菌具有明顯的抑菌作用，最大抑菌直徑可達30mm。經(jīng)測定，野生藍莓對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌7種菌的最低抑菌濃度（MIC）分別為：9.38、18.75、18.75、37.50、37.50、18.75、18.75mg/mL；紅豆越橘的最低抑菌濃度（MIC）分別為：18.75、18.75、37.50、37.50、37.50、18.75、18.75mg/mL。野生藍莓較紅豆越橘提取物抑菌活性穩(wěn)定，受紫外線照射、溫度、無機鹽等因素影響較小。結(jié)論：越橘提取物具有較強的廣譜抑菌效果，且受外界影響小，抑菌穩(wěn)定性好。在食品中添加越橘提取物，既能提高食品的功能品質(zhì)，又能提高食品的衛(wèi)生安全。

野生藍莓，紅豆越橘，抑菌譜，穩(wěn)定性

越橘（Billberry）歸于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬[1]，為多年生落葉常綠灌木或小灌木樹種。在我國，越橘品種表現(xiàn)為區(qū)域化生產(chǎn)，各品種群各有其特點，可以適應(yīng)各地的氣候條件。野生藍莓（blueberry）和紅豆越橘（Vaccinium vitis-idaea L）同為越橘屬的兩個品種，產(chǎn)自大興安嶺地區(qū)[2-4]。越橘不僅對人體防癌、防血管收縮、消除體內(nèi)自由基、延緩人體衰老等有重要作用，而且具有保護眼睛、抗氧化、提高記憶力、預(yù)防動脈粥樣硬化、抗尿路感染、抗癌、抗輻射等諸多功能[5]。越橘具有較強的藥理作用及保健功能，其營養(yǎng)成分不限于果糖、蛋白質(zhì)、脂肪、果膠、維生素等成分，更重要的是富含熊果苷、花色苷、類黃酮、多酚類物質(zhì)和細菌生長抑制劑等。根據(jù)美國Tufts大學(xué)的分析，在40種具有抗氧化能力的蔬菜和水果中，越橘原花青素的含量及抗氧化能力排名第一[6]。近年來，人們對多酚物質(zhì)抑制人類病原微生物給予高度的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)葡萄、蘋果、啤酒花和中國綠茶中的多酚物質(zhì)可以抑制牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）的生長[7]；葡萄酒和植物多酚可抑制幽門螺桿菌毒素并治療由其導(dǎo)致的疾病[8]；五倍子（Galla Chinensis）多酚提取物對變異鏈球菌（Streptococcus mutans）有抑制作用[9-10]。由此可見，多酚類物質(zhì)除了對人體或動物組織細胞代謝的直接作用外，還對致病微生物產(chǎn)生控制作用，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)人體消化道微生物菌落的作用[11]。因此本實驗以越橘為材料，研究了在不同的提取條件下越橘粗提液對6種食源性致病菌和1種食品中常見腐敗菌的抑菌作用及溫度、pH、紫外線等因素對抑菌穩(wěn)定性的影響，并測定其對各供試菌株的最低抑菌濃度。為越橘的進一步研究與開發(fā)提供科學(xué)的依據(jù)，也可為今后將越橘開發(fā)成一種天然的免疫抑菌劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella typhi）、志賀氏菌（Shigella）、枯草芽孢桿菌（Bacillus Sukatilis）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、溶血性鏈球菌（Streptococcus hemolyticus） 均為本院微生物教研室保藏菌種；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（PBA）[12]牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.2；野生藍莓、紅豆越橘 由大興安嶺塔河縣綠野山產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供。

自動式電熱壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40B） 上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；UNICO-2100紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；牛津杯 外直徑8mm，內(nèi)直徑6mm，高度10mm的不銹鋼制品。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試菌株的活化 將所有供試菌轉(zhuǎn)接入PBA試管斜面培養(yǎng)基上，每個菌接種多管，置于35～37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，每種菌取2支供測試用，其余注明日期，置于4℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 PBA平板培養(yǎng)基的制備 將配制好的PBA培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌（121℃、20min），冷卻至50～60℃，采用無菌操作傾注于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每培養(yǎng)皿裝15～20mL（皿內(nèi)培養(yǎng)基的厚度約3～5mm）即可，然后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 供試菌株懸浮液的制備 分別用接種針挑取少許活化后菌體接種于裝有玻璃珠及50mL無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩10min，制成均勻的菌懸液。用比濁法計數(shù)，調(diào)整菌懸浮液的濃度，使菌體量在106～107個/mL之間，備用。

1.2.4 兩種越橘粗提液的制備 精密稱取5g野生藍莓或紅豆越橘置于50mL無菌去離子水中，不同溫度下浸提2h，得水提液50mL，以22000r/min離心20min去沉淀，得100mg/mL野生藍莓或紅豆越橘水提液，冷藏備用，上述操作在無菌條件下進行。使用時用無菌水稀釋成所需濃度（100、90、80、70、60、50、40、30mg/mL）即可。

1.2.5 抑菌實驗方法 采用牛津杯法[13-14]。先分別用移液槍向PBA平板上加0.2mL各種菌懸液，并用無菌涂布器涂布均勻。用無菌鑷子夾取烘干的無菌牛津杯，輕輕平置于已涂布菌液的平板培養(yǎng)基表面，每個培養(yǎng)皿放置3只牛津杯，然后向每個牛津杯加入200μL不同質(zhì)量濃度的越橘粗提液，并以0.85%的無菌生理鹽水作對照。將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱35～37℃恒溫培養(yǎng)24h后，取出測定抑菌圈直徑，取平均值。抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好。每個供試菌種、每個提取濃度做3個重復(fù)。

1.2.6 最低抑菌濃度（MIC）的測定[15]采用二倍稀釋法將越橘提取物原液用去離子水稀釋成300、150、75、37.50、18.75、9.38mg/mL的系列濃度。采用混平板稀釋法[16]，分別吸取1mL不同濃度的提取物稀釋液于9mL已滅菌的PBA培養(yǎng)基中，混勻倒平板冷凝。用移液槍吸取100μL相應(yīng)菌懸液于平板中并涂布均勻，置于生化箱中培養(yǎng)，使其成為含一系列濃度梯度越橘提取物的微生物培養(yǎng)基平板。以加入無菌生理鹽水的培養(yǎng)基為對照，每個濃度做3個平行樣，菌落被完全抑制的濃度為最低抑菌濃度。

1.2.7 越橘提取液的穩(wěn)定性研究 取一定量1.2.4的樣品，用無菌去離子水稀釋后，進行如下處理：分別置于不同的溫度（20、40、60、80、100℃）條件下；將樣品調(diào)制成不同的pH（2、4、6、8、10）；取20mL樣品液置于培養(yǎng)皿中，打開皿蓋，在無菌室紫外燈下照射不同的時間（2、4、6、8、10h）；將氯化鈉配制成不同濃度（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）后加入到樣品中。根據(jù)1.2.5的方法研究越橘粗取液的抑菌作用，以抑菌圈直徑為評價指標(biāo)，測定越橘水提液在不同條件下的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種越橘水提液抑菌譜的研究

2.1.1 抑菌譜研究 從表1和表2可以看出，兩種越橘提取液對6種常見的食源性致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀氏菌細菌的抑制作用均比較顯著，對食品污染中常見細菌枯草芽孢桿菌的抑菌作用也較強。越橘提取液濃度與抑菌活性之間具有明顯的量效關(guān)系，即隨著越橘提取液濃度的升高，抑菌作用加強。濃度在60～100mg/mL范圍內(nèi)抑菌作用較強，尤其是對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，野生藍莓對金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑可達30.0mm、大腸桿菌達22.0mm、產(chǎn)氣桿菌12mm、沙門氏菌20.0mm、溶血性鏈球菌22.5mm、志賀氏菌達21.5mm、枯草桿菌23.0mm；紅豆越橘對金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑為26.6mm，大腸桿菌達23.5mm、產(chǎn)氣桿菌12.8mm、溶血性鏈球菌19.6mm、沙門氏菌16.2mm、枯草芽孢桿菌14.6mm、志賀氏菌16.8mm。

2.1.2 最低抑菌濃度（MIC）的研究 從表3和表4中可看出，即使是在較低的濃度條件下，野生藍莓水提液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑制作用都比較強，野生藍莓提取液對大腸桿菌的MIC低至18.75mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC更是低達9.38mg/mL，對枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、溶血性鏈球菌、志賀氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌的MIC值分別為：18.75、18.75、37.50、37.50、18.75mg/mL；紅豆越橘提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC為18.75mg/mL，對沙門氏菌、溶血性鏈球菌、志賀氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌的MIC值分別為：18.75、37.50、37.50、18.75mg/mL。

表1 野生藍莓水提液抑菌譜Table 1 Antibacterial spectrum of water extract of wild blueberry

表2 紅豆越橘水提液抑菌譜Table 2 Antibacterial spectrum of water extract of Vaccinium vitis-idaea L

表3 野生藍莓水提液的最低抑菌濃度Table 3 MIC of water extract of wild blueberry

表4 紅豆越橘水提液的最低抑菌濃度Table 4 MIC of water extract of Vaccinium vitis-idaea L

2.2 越橘提取液抑菌穩(wěn)定性研究

圖1 野生藍莓在不同溫度下的抑菌作用Fig.1 Antimicrobial activity of wild blueberry at different temperatures

2.2.1 溫度對越橘水提液抑菌效果的研究 以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，測定不同溫度下野生藍莓和紅豆越橘提取物的抑菌活性。由圖1可知，隨著處理溫度的升高，野生藍莓抑制大腸桿菌活性有所升高，但是變化不大，120℃處理后仍然具有較好的抑菌作用；對金黃色葡萄球菌的抑菌活性表現(xiàn)為不穩(wěn)定性，時高時低；對枯草芽孢桿菌的穩(wěn)定性較好，隨著溫度的升高抑菌活性變化不大。由圖2可以看出，紅豆越橘提取液隨溫度的升高，抑菌穩(wěn)定性較差，對三種指示菌的抑菌作用均不太穩(wěn)定，總體上隨著溫度升高對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用有所增強，且抑菌圈直徑均大于6mm。

圖2 紅豆越橘在不同溫度下的抑菌作用Fig.2 Antimicrobial activity of Vaccinium vitis-idaea L at different temperatures

2.2.2 紫外線對越橘提取液抑菌效果的研究 以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，研究紫外照射對越橘提取物抑菌活性的影響。由圖3可以看出，野生藍莓提取液經(jīng)紫外線照射10h后對三種菌均有較好的抑制作用。照射時間為4h時，對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑仍能達到30mm，同時隨照射時間的延長，抑菌效果相對較穩(wěn)定。由圖4可以看出，紅豆越橘提取液在紫外線照射下對大腸桿菌的抑制作用較穩(wěn)定，隨紫外線照射時間的延長，抑菌作用基本保持不變；而對另外兩種菌則不穩(wěn)定，隨時間的延長抑菌作用明顯減弱，照射4h后提取液對枯草芽孢桿基本沒有抑制作用?？傊?，經(jīng)紫外線照射處理后的野生藍莓提取物的抑菌穩(wěn)定性比紅豆越橘好。

圖3 紫外照射時間對野生藍莓抑菌作用的影響Fig.3 Antimicrobial activity of wild blueberry at different UV irradiation time

圖4 紫外照射時間對紅豆越橘抑菌作用的影響Fig.4 Antimicrobial activity of Vaccinium vitis-idaea L at different UV irradiation time

2.2.3 pH對越橘水提液抑菌效果的研究 以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，測定不同pH對兩種越橘提取物抑菌活性的影響。由圖5可知，野生藍莓在pH大于6時對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均沒有抑菌作用，但對大腸桿菌卻依然有較穩(wěn)定的抑菌活性。由圖6可知，當(dāng)pH由強酸性變?yōu)橹行詴r，紅豆越橘對枯草芽孢桿菌的抑制作用較穩(wěn)定，基本保持不變；pH小于8時對金黃色葡萄球菌抑菌作用較強，pH大于8就逐漸失去抑菌活性；對大腸桿菌，隨著pH的增大紅豆越橘的抑菌活性還有所提高。綜合來看，兩種越橘提取物的抑菌活性均在酸性條件下更穩(wěn)定。

圖5 野生藍莓在不同pH條件下的抑菌作用Fig.5 Antimicrobial activity of wild blueberry at different pH

圖6 紅豆越橘在不同pH條件下的抑菌作用Fig.6 Antimicrobial activity of Vaccinium vitis-idaea L at different pH

2.2.4 氯化鈉對越橘水提液抑菌效果的研究 以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，研究氯化鈉對越橘提取物抑菌活性的影響。由圖7可知，氯化鈉濃度的變化對野生藍莓抑菌活性影響很小，且抑菌圈直徑都在14mm以上，抑菌穩(wěn)定性好。由圖8可以看出，隨著氯化鈉濃度的增大，紅豆越橘對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用減弱，抑菌穩(wěn)定性較差；對金黃色葡萄球菌則影響不大，具有較好的抑菌穩(wěn)定性。綜上所述，有氯化鈉存在時野生藍莓的抑菌穩(wěn)定性比紅豆越橘好。

圖7 野生藍莓在不同無機鹽濃度條件下的抑菌作用Fig.7 Antimicrobial activity of wild blueberry at different content of inorganic salts

圖8 紅豆越橘在不同無機鹽濃度條件下的抑菌作用Fig.8 Antimicrobial activity of Vaccinium vitis-idaea L at different content of inorganic salts

3 結(jié)論

越橘粗提液對6種食源性致病菌和食品中常見腐敗菌（枯草芽孢桿菌）都有較強的抑制活性。兩種越橘粗提液濃度在60～100mg/mL范圍內(nèi)抑菌作用較強，尤其是對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，野生藍莓對金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑可達30.0mm、大腸桿菌達22.0mm、產(chǎn)氣桿菌12mm、沙門氏菌20.0mm、溶血性鏈球菌22.5mm、志賀氏菌達21.5mm、枯草芽孢桿菌23mm；紅豆越橘對金黃色葡萄球菌為26.6mm，大腸桿菌達23.5mm、產(chǎn)氣桿菌12.8mm、溶血性鏈球菌19.6mm、沙門氏菌16.2mm、枯草芽孢桿菌14.6mm、志賀氏菌16.8mm。同時經(jīng)測定，野生藍莓對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌7種菌的最低抑菌濃度分別為：9.38、18.75、18.75、37.50、37.50、18.75、18.75mg/mL；紅豆越橘的最低抑菌濃度分別為：18.75、18.75、18.75、37.50、37.50、18.75、18.75mg/mL。

另外，經(jīng)紫外線照射處理后的野生藍莓提取物的抑菌穩(wěn)定性比紅豆越橘更好，有氯化鈉存在時野生藍莓的抑菌穩(wěn)定性也比紅豆越橘好，兩種越橘提取物的抑菌活性均在酸性條件下更穩(wěn)定，在20～120℃范圍內(nèi)均具有較好的抑菌活性。總體上看，野生藍莓提取物抑菌活性較穩(wěn)定，受環(huán)境因素影響較小。如將純化的越橘提取液應(yīng)用于食品的防腐保鮮，其能夠適應(yīng)不同食品的加工環(huán)境，從而起到延長食品保質(zhì)期的目的。

越橘提取物具有較強的廣譜抑菌效果，且受外界影響小，抑菌穩(wěn)定性好。在食品中添加越橘提取物，既能提高食品的功能品質(zhì)，又能提高食品的衛(wèi)生安全。越橘提取物有成為一種廣譜、安全、高效的天然抑菌劑的潛力。

[1]Wu yang hu，Timothy Woods，Sandra Bastin.Consumer acceptance and willingness to pay for blueberry products with nonconventional attributes[J].Agricultural and Applied Economics，2009，41：47-60.

[2]張玉萍.越橘的保健作用及其在我國的開發(fā)利用前景[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（4）：22-25.

[3]鄒陽，張秀玲，石岳.野生藍莓果實中花色苷色素提取工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技，2007，21（1）：60-62.

[4]章海燕，王立，張暉.烏飯樹葉不同提取物抑菌作用的初步研究[J].食品科技，2010，17（1）：34-37.

[5]Barbara M Schmidt，John W Erdman，Mary Ann Lila，et al. Effects of food processing on blueberry antiproliferation and antioxidant activity[J].Nutrition，2005，26：389-394.

[6]Otake S，M Makimura.Anticaries effects of polyphenolic compounds from Japanese green tea[J].Caries Res，1991，25（6）：438-443.

[7]李建慧，馬會勤，陳尚武.葡萄多酚抑菌效果的研究[J].中國食品學(xué)報，2008（2）：101-107.

[8]關(guān)麗華，王秀華.紅豆越橘中化學(xué)成分的研究進展[J].北方園藝，2007（4）：81-83.

[9]Tombola F，S Campello.Plant polyphenols inhibit VacA，a toxin secreted by the gastric pathogen Helicobacterpylori[J]. FEBS Lett，2003，543（1-3）：184-189.

[10]Navindra P Seeram.Berry fruits for cancer prevention：current status and future prospects[J].Agric Food Chem，2008，56：360-365.

[11]Eugene Emile Nicoue，Sylvain Savard，Khaled Belkacemi. Anthocyanins in wild blueberries of quebec：extraction and identification[J].Agric Food Chem，2007，55：5626-5635.

[12]孟曉，馬力.苦瓜提取液的抑菌譜及其穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)，2010（2）：47-49.

[13]R Puupponen-Pimiaè，L Nohynek，C Meier，et al. Antimicrobial properties of phenolic compounds from berries[J]. Applied Microbiology，2001，90：494-507.

[14]Bremer Vanessa，Crisosto Gayle，Crisosto Carlos H，et al. San Joaquin valley blueberries evaluated for quality attributes[J]. California Agriculture，2008，62：58-62.

[15]蔣立文，彭巧云，易燦，等.納豆提取物抑菌效果的研究[J].中國食品學(xué)報，2008（6）：86-90.

[16]牛天貴.食品微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002.

Study on antimicrobial properties and stability of extracts from berries

CHEN Sha，LUO Qiu-shui，ZHANG Feng-ying*
（School of Food Science and Technology，Jiangxi Agriculture University，Nanchang 330045，China）

Antimicrobial properties and stability of extracting solution from two billberries（wild blueberry and Vaccinium vitis-idaea L）were studied.The antimicrobial properties of extracting solution from two berries against six food-borne pathogens and one spoilage bacteria from food were screened by oxford cup and doubling dilution method measured minimum inhibitory concentration（MIC），the antimicrobial stability under certain temperature，pH，UV exposure time and so on.The result showed that bacterias like Staphylococcus aureus and other six bacterial were inhibited by the extracting solution well.The biggest antibacterial circle diameter reached 30.0mm.the MIC of blueberry extracts against Staphylococcus aureus was 9.38mg/mL，Escherichia coli 18.75mg/mL，Enterobacter aerogenes 18.75mg/mL，Salmonella typhi 37.50mg/mL，Streptococcus hemolytic 37.50mg/mL，Shigella 18.75mg/mL，Bacillus Sukatilis 18.75mg/mL.The MIC of Vaccinium vitis-idaeaL extracts against Staphylococcus aureus was 18.75mg/mL，Escherichia coli 18.75mg/mL，Enterobacter aerogenes 37.50mg/mL，Salmonella typhi 37.50mg/mL，Streptococcus hemolytic 37.50mg/mL，Shigella 18.75mg/mL，Bacillus Sukatilis 18.75mg/mL.Extracts under acid conditions had good antibacterial effect，antibacterial activity of wild blueberry extracts was more stable.By UV exposure time，temperature，inorganic salts and other environmental factors less effected.Conclusions：billberry had strong broad-spectrum antimicrobial effects，and little outside influence，antibacterial stability，added billberry extracts in food，not only the function of quality was improved but also the food safety.

wild blueberry；Vaccinium vitis-idaea L；antibacterial spectrum；stability

TS255.1

A

1002-0306（2012）09-0158-05

2011－09－07 *通訊聯(lián)系人

陳沙（1986-），女，在讀碩士，研究方向：食品微生物與發(fā)酵工程。