分子動(dòng)力學(xué)模擬研究活化劑對(duì)葡萄糖激酶活性的影響及活化機(jī)理

姚雪霞

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京210031）

分子動(dòng)力學(xué)模擬研究活化劑對(duì)葡萄糖激酶活性的影響及活化機(jī)理

姚雪霞

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京210031）

葡萄糖激酶（GK）催化葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?－磷酸葡萄糖，是糖代謝的第一步；GK的活性改變對(duì)葡萄糖的代謝影響很大.通過分子動(dòng)力學(xué)模擬研究了葡萄糖激酶活化劑（GKA）對(duì)GK活性的影響，探討了GKA的活化機(jī)理.包結(jié)自由能分析表明，范德華作用是GK和GKA體系的主要驅(qū)動(dòng)力；與此同時(shí)，葡萄糖使得GK和GKA的結(jié)合增強(qiáng).構(gòu)象分析結(jié)果表明，GKA能夠在一段時(shí)間內(nèi)限制GK的構(gòu)象，但不能長(zhǎng)久維持GK的活化構(gòu)象不變，這和以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致.相關(guān)理論分析結(jié)果不僅有利于從原子水平解釋GKA的活化機(jī)理，也可為設(shè)計(jì)新的用于糖尿病治療的GKA提供一定的理論參考.

葡萄糖激酶；活化劑；活性；活化機(jī)理；分子動(dòng)力學(xué)模擬

葡萄糖激酶（GK）催化葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?－磷酸葡萄糖，是糖代謝極為關(guān)鍵的一步，所以GK活性異常在糖代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［1－2］.文獻(xiàn)［3］對(duì)GK的晶體結(jié)構(gòu)和催化過程進(jìn)行了研究，認(rèn)為GK存在三種構(gòu)象，即：關(guān)閉型、開啟型和超開啟型.其中，前兩種為活性構(gòu)象，第3種為非活性構(gòu)象.其催化過程如下：當(dāng)血糖濃度較低時(shí)，GK主要以穩(wěn)定的超開啟構(gòu)象存在，當(dāng)葡萄糖分子與之結(jié)合后，其構(gòu)象緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)殚_啟型構(gòu)象，然后轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)閉型構(gòu)象，在ATP存在下同時(shí)發(fā)生酶催化反應(yīng)——葡萄糖磷酸化.反應(yīng)結(jié)束后GK回復(fù)到開啟型構(gòu)象，同時(shí)釋放出6－磷酸葡萄糖（G6P）和ADP.若有新的葡萄糖分子結(jié)合則繼續(xù)發(fā)生磷酸化，進(jìn)入快循環(huán)；若沒有新的葡萄糖分子結(jié)合，GK則轉(zhuǎn)變?yōu)槌_啟構(gòu)象，進(jìn)入慢循環(huán).若GK的氨基酸殘基發(fā)生失活突變，則影響相應(yīng)的催化過程，導(dǎo)致青年型早發(fā)糖尿病（MODY 2）［4］發(fā)生.為了治療MODY 2型糖尿病，以GK為靶點(diǎn)的小分子活化劑（GKA）的研究非常活躍，并取得了很大的進(jìn)展［5－9］.

觀察GK的晶體結(jié)構(gòu)［8］（如圖1所示），發(fā)現(xiàn)GK由448個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，折疊成大小不等的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，中間凹槽為連接域，葡萄糖分子磷酸化的活性位點(diǎn)位于該連接域內(nèi)，而GKA則位于GK的異構(gòu)點(diǎn)，距離葡萄糖底物大約2nm左右.雖然實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)GKA可以提高GK的活性，但是還是有很多基本問題沒有解決.如，異構(gòu)點(diǎn)距離葡萄糖底物的距離為2nm左右，GKA如何提高GK的活性？文獻(xiàn)［10］雖然討論了其中一個(gè)GKA對(duì)GK的影響，但是還有很多細(xì)節(jié)問題沒有解決.如GKA是否一直對(duì)GK的構(gòu)象起著約束作用？另外葡萄糖的存在反過來對(duì)GKA有什么影響？以及其他GKA對(duì)GK的影響是否相同？為了解決這些疑問，很有必要對(duì)其他GKA對(duì)GK的活化機(jī)理做進(jìn)一步的理論研究.

以往我們?cè)治鯣K的活化突變對(duì)GK活性的影響［11－12］，發(fā)現(xiàn)它們主要通過約束GK的構(gòu)象來改變GK的活性.活化劑是否采用同樣的方式來改變GK的活性呢？為了研究GKA的活化機(jī)理，作者通過分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamical，MD）模擬和 MM－PBSA（molecular mechanics／Poisson Boltzmann surface area）方法［13－14］，對(duì)GKA、GK以及葡萄糖的相互作用進(jìn)行了理論研究.

1 理論與方法

1.1 蛋白質(zhì)構(gòu)建

由于第一個(gè)包含GK、GKA和葡萄糖復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)［3］缺少實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)EC50值，因此本文作者選用了一個(gè)新研制出來的晶體結(jié)構(gòu)［8］作為研究對(duì)象.該體系和第一個(gè)體系相比，只有GKA不同，GKA的分子結(jié)構(gòu)如圖2所示.

GK－GKA－glucose復(fù)合體系的初始結(jié)構(gòu)取自于文獻(xiàn)（PDB code：3FR0）［8］.目前單獨(dú)的GK－glucose和單獨(dú)的GK－GKA晶體結(jié)構(gòu)還沒有文獻(xiàn)報(bào)道，因此單獨(dú)的GK－glucose和GK－GKA只能從復(fù)合體系中去掉另一個(gè)小分子作為初始結(jié)構(gòu).另外本文中所指的GK－free是指直接從GK－GKA－glucose復(fù)合體系中去掉GKA和葡萄糖兩個(gè)小分子得到的GK結(jié)構(gòu)，并不是真正的晶體結(jié)構(gòu)GK－free.

圖1 GK－活化劑－葡萄糖復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)Fig.1 The crystal structure of GK in complex with GKA and glucose

圖2 GKA的分子結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formulas of the GKA

1.2 MD模擬

MD模擬的初始結(jié)構(gòu)如上所述.所有的MD模擬均采用AMBER 10程序包［15］.AMBER03力場(chǎng)用于蛋白質(zhì)分子，GAFF力場(chǎng)用于葡萄糖和GKA小分子.葡萄糖和GKA小分子都采用Gaussian 03程序包［16］的HF／6－31G＊基組優(yōu)化，采用RESP程序計(jì)算其電荷.程序LeaP用于中和體系，使其總電荷為零.

對(duì)于所有體系，均在溶質(zhì)外圍加上1nm的水分子層.采用周期性邊界條件和particle mesh ewald（PME）方法用于處理長(zhǎng)程靜電作用［17］.非鍵截距為1.2nm，使用SHAKE選項(xiàng)用于約束和氫原子連接的鍵.

在運(yùn)行MD之前，先進(jìn)行兩步能量?jī)?yōu)化：第一步約束溶質(zhì)，用最速下降法優(yōu)化5 000步，再用共軛梯度法優(yōu)化5 000步；第二步去約束后再優(yōu)化整個(gè)體系，用最速下降法優(yōu)化2 500步，再用共軛梯度法優(yōu)化2 500步，收斂條件為能量梯度小于4.18×10－4kJ·mol－1·nm－1.

MD模擬分為兩步：首先進(jìn)行200ps的約束溶質(zhì)分子MD模擬，即通過200ps預(yù)熱，將體系從0K加熱到300K；然后進(jìn)行10ns無約束恒溫MD模擬，溫度為300K，壓力為1×105Pa（即NPT系綜）.系統(tǒng)的溫度和壓力則通過Langevin piston和Hoover’s thermostat實(shí)現(xiàn)控制.模擬中采用的積分步長(zhǎng)為2fs，非鍵連接表每50步更新一次.每4ps保存一次軌跡結(jié)構(gòu)用于后期數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 MD軌跡穩(wěn)定性的分析

體系在模擬過程中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)相對(duì)于晶體結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化的均方根偏差（RMSD）是衡量體系是否穩(wěn)定和達(dá)到收斂的重要依據(jù).為了檢測(cè)MD軌跡的穩(wěn)定性，分別對(duì)GK－free，GK－GKA，GK－glucose和 GK－GKA－glucose四個(gè)軌跡中GK的Cα原子進(jìn)行RMSD分析，結(jié)果如圖3所示.分析圖3，發(fā)現(xiàn)相比于其他軌跡，GK－free的軌跡RMSD值最大，最不穩(wěn)定.而GK－glucose和GK－GKA－glucose的RMSD值比較小，軌跡相對(duì)穩(wěn)定一些.但是仔細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)GK－GKA－glucose的軌跡最穩(wěn)定.這表明GKA的存在，可以使得GK－glucose體系更加穩(wěn)定.

2.2 GKA和GK之間靜電作用的分析

分析其晶體結(jié)構(gòu)（如圖1所示），可以看到GKA處于GK背部的空腔內(nèi)，不僅和GK有非鍵的范德華作用，而且還有氫鍵作用.晶體結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的氫鍵，在動(dòng)態(tài)的MD過程中會(huì)有什么變化？下面分別討論兩種MD情況下GK和GKA之間的氫鍵隨時(shí)間的變化：（1）GK和GKA單配體作用.從圖4（A）中可以看到其中的兩個(gè)氫鍵非常穩(wěn)定，只有第三個(gè)氫鍵不太穩(wěn)定，在MD運(yùn)行到3ns附近發(fā)生斷裂，在6ns左右又重新形成；（2）GK和GKA、葡萄糖雙配體作用.分析三個(gè)氫鍵距離隨模擬時(shí)間的變化，可以發(fā)現(xiàn)在整個(gè)MD過程中，三個(gè)氫鍵都非常穩(wěn)定.由于以上兩種情況下MD模擬參數(shù)都完全相同，唯一的區(qū)別在于第二種情況下含有葡萄糖小分子.因此我們可以得出這樣的結(jié)論，即葡萄糖的存在使GK和GKA的結(jié)合更加穩(wěn)定.這和文獻(xiàn)報(bào)道［3］一致，即GKA可以提高GK對(duì)葡萄糖的活性，同時(shí)葡萄糖的存在，反過來又可以促進(jìn)GK和GKA的結(jié)合.迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)在沒有葡萄糖存在的條件下，GK和GKA單配體結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，這也說明GK單獨(dú)和GKA在一起是不能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在的.

圖3 GK Cα原子在10ns MD模擬過程中的RMSD軌跡Fig.3 The RMSD trajectories of Cαatoms of GK during 10ns MD simulations

圖4 GK和GKA之間的氫鍵鍵長(zhǎng)隨時(shí)間的變化Fig.4 Time evolution of three hydrogen bond lengths between GK and GKA

2.3 GKA和GK之間包結(jié)自由能的分析

通過MM－PBSA方法［11］計(jì)算了兩個(gè)模擬體系 （GK－GKA和GK－GKA－glucose）中GKA和GK之間的相互作用能，結(jié)果如表1所示.分析計(jì)算結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不論是哪一種模擬體系，GK和GKA之間的主要作用力都是范德華力.盡管GK和GKA之間真空下的靜電作用能為負(fù)值，但是極性的溶劑化能卻是一個(gè)更大的正值，導(dǎo)致它們之間總的靜電作用能為正值，不利于GK和GKA的穩(wěn)定結(jié)合.通過能量計(jì)算表明，GKA主要是通過范德華力和GK結(jié)合在一起.

表1 GK和配體的包結(jié)自由能 （kJ·mol－1）aTable 1 Binding free energy of the ligands and GK

另外分析GK－GKA和GK－GKA－glucose兩個(gè)體系的能量差別，發(fā)現(xiàn)葡萄糖的存在，使得GK和GKA之間的能量變得更低.具體分析各個(gè)能量項(xiàng)，發(fā)現(xiàn)主要的差別不是范德華力，而是靜電作用力.葡萄糖的存在使得GK－GKA之間的靜電作用能變低，最終導(dǎo)致總的包結(jié)能降低.以上的計(jì)算結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道［3］一致，即葡萄糖可以促進(jìn)GK和GKA的穩(wěn)定結(jié)合.

2.4 GKA對(duì)GK構(gòu)象影響的分析

前面我們分析了GK和GKA之間的主要作用力.下面將分析GKA對(duì)GK構(gòu)象的影響.首先分析GKA對(duì)GK夾角的影響（如圖5所示）.從圖5中可以看到對(duì)于GK－free，大小域的夾角在開始的1ns變化很大，從15°迅速增加到30°左右.隨后，GK－free夾角的值趨于穩(wěn)定，說明GK達(dá)到一種相對(duì)較穩(wěn)定的構(gòu)象.GK－free夾角的這種變化趨勢(shì)和其RMSD的變化趨勢(shì)相一致，從圖3中可以看到，其RMSD值在開始的1 ns上升非?？?，迅速達(dá)到3nm后趨于穩(wěn)定.和GK－free相比，加了GKA以后，GK大小域的夾角和初始結(jié)構(gòu)夾角相比，變化較小.從圖5中可以看到，在整個(gè)5ns時(shí)間內(nèi)，夾角的值比較穩(wěn)定，在18°左右波動(dòng).因此可以得出GKA對(duì)GK的構(gòu)象變化確實(shí)起到了一種門閂的作用，約束著GK大小域的開合.但是5ns以后，我們發(fā)現(xiàn)GKGKA體系的夾角從18°增加到22°.以上結(jié)果表明GKA可以在一段時(shí)間內(nèi)約束GK的構(gòu)象，使之處于活化狀態(tài)，但不能一直保持GK的構(gòu)象不變，這和以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的［3］.

為了進(jìn)一步研究GKA對(duì)GK構(gòu)象的影響，分別用動(dòng)態(tài)相關(guān)性矩陣（Dynamic cross－correlation matrices，DCCM）［18－19］分析了四種MD情況下GK 448個(gè)氨基酸殘基內(nèi)部的相關(guān)性，如圖6所示.DCCM最吸引人的地方在于預(yù)測(cè)一些非相鄰的氨基酸之間的動(dòng)態(tài)相關(guān)性，也就是我們通常所說的蝴蝶效應(yīng)，這是靜態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)無法提供的.因此DCCM已被廣泛用于蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)相關(guān)性分析［18－19］，并取得了很好的預(yù)測(cè)效果.

圖5 GK－free和GK－GKA的夾角隨時(shí)間的進(jìn)展圖Fig.5 Cleft－angle profiles along the GK－free and GK－GKA trajectories

圖6 GK的DCCM動(dòng)態(tài)相關(guān)性分析Fig.6 DCCM illustrating the correlation of motion between residues in GK

圖6 （A）為GK－free的DCCM 圖，從圖6（A）可以看到，大部分氨基酸殘基的相關(guān)性很小，顏色以淺藍(lán)色和綠色為主，很小的黃色區(qū)域表示該區(qū)域的氨基酸殘基之間存在正的相關(guān)性.另外還存在一些很小的藍(lán)色區(qū)域，表示該部分殘基之間的負(fù)相關(guān)性較強(qiáng).

和GK－free相比，GK－GKA的氨基酸殘基負(fù)相關(guān)性非常明顯，部分區(qū)域的顏色顯示為深藍(lán)色（如圖6（B）所示）.仔細(xì)分析，我們發(fā)現(xiàn)GK 300～400的氨基酸殘基和100～150的氨基酸殘基之間有很明顯的負(fù)相關(guān)性.進(jìn)一步分析晶體結(jié)構(gòu)（如圖7所示），發(fā)現(xiàn)300～400的氨基酸殘基位于GK的大域，而100～150的氨基酸殘基位于GK的小域，它們之間相距甚遠(yuǎn).在沒有GKA存在的情況下，它們之間并沒有負(fù)相關(guān)性運(yùn)動(dòng)，但是在GKA存在的情況下，這種負(fù)相關(guān)運(yùn)動(dòng)則非常明顯.表明GKA可以影響GK大小域的開合運(yùn)動(dòng).這和我們前面分析GKA對(duì)GK夾角的影響是一致的.

GK－glucose的DCCM如圖6（C）所示.分析圖6（C）發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖存在的情況下，GK的正負(fù)相關(guān)性運(yùn)動(dòng)都非常不明顯，可忽略不計(jì).我們推測(cè)是因?yàn)镚K和葡萄糖的強(qiáng)烈靜電作用，導(dǎo)致GK的構(gòu)象非常穩(wěn)定，所以觀察不到GK的相關(guān)性運(yùn)動(dòng).

最后一個(gè)DCCM圖用來說明GK－GKA－glucose的氨基酸殘基的相關(guān)性運(yùn)動(dòng)（見圖6（D））.分析圖6（D）發(fā)現(xiàn)，GK－GKA－glucose的負(fù)相關(guān)性介于GK－GKA和GK－glucose之間.我們推測(cè)是因?yàn)槠咸烟呛虶K的相互作用，導(dǎo)致GKA對(duì)GK的負(fù)相關(guān)性影響減小.

以上DCCM分析和作者以前所研究的Y214C［11］和M197V［12］活性突變的DCCM結(jié)果基本相同.表明該活化劑的作用類似于GK本身的一些活性突變，都是通過約束GK的構(gòu)象來提高GK的活性.

圖7 GK（綠色），殘基ID：100～150（紅色）和殘基ID：300～400（紫色）Fig.7 GK （green），RES ID：100～150（red）and RES ID：300～400（purple）

3 結(jié)論

通過分子動(dòng)力學(xué)模擬分析了GKA和GK的相互作用.包結(jié)自由能分析表明，范德華作用是GK和GKA體系的主要驅(qū)動(dòng)力.同時(shí)葡萄糖的存在使得GK和GKA結(jié)合得更加穩(wěn)定.構(gòu)象分析表明，GKA可以在一段時(shí)間約束GK的構(gòu)象，但是不能一直維持GK的活化構(gòu)象不變，這和以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致.本研究從原子水平解釋了GKA的活化機(jī)制，為今后設(shè)計(jì)新的GKA小分子提供了一定的理論參考.

致謝：南京大學(xué)理論與計(jì)算化學(xué)研究所提供計(jì)算機(jī)服務(wù)器用于計(jì)算.

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Effect of activator on activity of glucokinase and activation mechanism of the activator—study by molecular dynamics simulation

YAO Xuexia
（College of Engineering，Nanjing Agricultural University，Nanjing210031，Jiangsu，China）

Glucokinase（GK）is a glycolic enzyme that catalyzes the phosphorylation of glucose to glucose－6－phosphate in the first step of glycolysis，and the change in GK activity plays an important role in abnormal glycemia.Thus molecular dynamics simulation was performed to study the effect of glucokinase activator（GKA）on the activity of GK，and the activation mechanism of GKA was examined.The binding free－energy analysis suggests that van der Walls forces are the main driving forces for GK－GKA complex，and glucose can enhance the binding between GK and GKA.Moreover，conformation analysis shows that GKA can constrain the conformation of GK in a period of time，but it cannot keep the active state of GK in an extended period，which is in agreement with previously reported experiment results.These observations are beneficial to understanding the activation mechanism of GKA at an atomic level and to guiding the design of novel GKA for the treatment of diabetes.

glucokinase；activator；activity；activation mechanism；molecular dynamic simulation

O 629.8

A

1008－1011（2012）04－0091－06

2011－12－20.

江蘇省農(nóng)機(jī)局科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（gxz10008）.

姚雪霞（1975－），女，講師，研究方向?yàn)槲锢砘瘜W(xué).E－mail：yaoxx0623＠sina.com.