HPLC法同時(shí)測定肺閉寧顆粒中麻黃堿與偽麻黃堿含量

孫 蓓 ，張 蓓 ，陳雙璐

（1.天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院門診辦公室，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300060；2.天津市第一中心醫(yī)院藥劑科，天津300192；3.天津市兒童醫(yī)院藥劑科，天津300074）

肺閉寧顆粒是以天津市兒童醫(yī)院老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)處方為基礎(chǔ)，經(jīng)工藝改良后制成的醫(yī)院制劑，由黃芩、枳殼、麻黃等中藥組成，具有宣肺解熱、化痰定喘之功效。麻黃在制劑中為君藥，其有效成分麻黃堿有松弛平滑肌、收縮血管作用，為麻黃平喘的主要成分；另一有效成分偽麻黃堿，可用于傷風(fēng)感冒、鼻黏膜消炎[1]。由于麻黃屬于控制的毒麻類成分，為了有效控制該制劑的質(zhì)量，提出了用高效液相色譜法測定其中鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿的含量，取得滿意效果。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥 LC-2010A型高效液相色譜儀，紫外檢測器，Lcsolution工作站（日本島津公司）；雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)171241-200506）、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)171237-200505）均由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈、磷酸、三乙胺為色譜純；水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；肺閉寧顆粒（天津市兒童醫(yī)院制劑）；其余試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS(150 mm×4.6mm)；流動(dòng)相：乙腈-水-磷酸-三乙胺（3∶97∶0.1∶0.2）；檢測波長為 213 nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對(duì)照品溶液：精密稱取105℃干燥至恒重的鹽酸麻黃堿對(duì)照品5.70mg、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品4.45mg置10mL量瓶中，加甲醇超聲使溶解后，稀釋至刻度，搖勻。精密量取2mL置10mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL含鹽酸麻黃堿114μg、鹽酸偽麻黃堿89μg）。

1.2.2.2 供試品溶液：取肺閉寧顆粒約3 g，精密稱定，加水20mL使其混懸均勻，加濃氨水1mL，用三氯甲烷提取 4次（20，20，15，15mL），合并三氯甲烷提取液，加鹽酸乙醇液（1→20）1mL，低溫蒸干，殘?jiān)芯芗尤臌}酸乙醇液（1→20）2mL使溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，用流動(dòng)相洗滌容器并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.3 陰性樣品溶液：按處方比例及制法，制成缺麻黃的陰性對(duì)照樣品[2]，取約3 g，精密稱定，按照“1.2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液[2]。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀測定。結(jié)果表明，供試品溶液與對(duì)照品溶液出現(xiàn)保留時(shí)間相同的色譜峰，而陰性對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，證明其他藥材及輔料成分對(duì)測定結(jié)果無干擾。見圖1。麻黃堿與偽麻黃堿的保留時(shí)間分別為12.259min和13.773min，分離度R≥1.5，滿足含量測定要求。

2.2 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液適量，依次注入高效液相色譜儀 4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 μL，按照“1.2.1”項(xiàng)色譜條件測定，以濃度（μg）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為：鹽酸麻黃堿Y=1 810 115.79X+3 664.86，r=0.999 99（n=6）；鹽酸偽麻黃堿：Y=1 855 704.49X+4 290.53，r=0.999 97（n=6）。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿在0.456～1.596μg濃度范圍內(nèi)、鹽酸偽麻黃堿在0.356～1.246μg濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 取“1.2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測定鹽酸麻黃堿峰與鹽酸偽麻黃堿面積。結(jié)果表明鹽酸麻黃堿峰面積平均值為2 063 725，RSD為0.60%；鹽酸偽麻黃堿峰面積平均值為1 650 330，RSD為0.45%，精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品（20111101）6份，按照“1.2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，每次進(jìn)樣量為10μL，結(jié)果樣品中鹽酸麻黃堿平均含量為0.365 1mg/g，RSD為1.07%；鹽酸偽麻黃堿平均含量為0.230 7mg/g，RSD為1.11%。表明方法的重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（20111101）的樣品適量，按照“1.2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按照“1.2.1”項(xiàng)色譜條件分析，分別在 0、2、4、6、8 h進(jìn)樣10μL，測得鹽酸麻黃堿峰面積值的RSD為0.71%，鹽酸偽麻黃堿面積值的RSD為0.83%。

2.6 加樣回收試驗(yàn) 取同一批號(hào)（20111101）已知含量的樣品適量，研成粉末，取1.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液（0.565 mg·mL-1）1mL、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品溶液（0.412mg·mL-1）1mL，按照“1.2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，制得供測定回收率用供試品溶液，按照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，進(jìn)樣10μL，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率分別為：鹽酸麻黃堿99.49%，RSD為1.73%；鹽酸偽麻黃堿98.56%，RSD為1.12%（表1、2）。

表1 鹽酸麻黃堿加樣回收率試驗(yàn)Tab1 Ephedrinehydrochloride recovery rate test

表2 鹽酸偽麻黃堿加樣回收率試驗(yàn)Tab2 Pseudoephedrinehydrochloride recovery rate test

2.7 樣品含量測定 取4批肺閉寧顆粒樣品，按照“1.2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按照“1.2.1”項(xiàng)色譜條件分析，進(jìn)樣10μL，計(jì)算樣品中鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿的含量。結(jié)果見表3。

表3 肺閉寧顆粒中鹽酸麻黃堿（…）與鹽酸偽麻黃堿（…）的含量Tab3 Ephedrinehydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride content of Feibining granules

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道可采用超聲法提取中藥制劑中鹽酸麻黃堿，然而試驗(yàn)證明，此法雖簡單易行，但肺閉寧顆粒成分復(fù)雜，簡單的超聲提取后，樣品溶液在液相色譜中不能達(dá)到很好的基線分離[3-5]。本試驗(yàn)利用麻黃堿與偽麻黃堿都能溶于水，加堿后的游離物能被三氯甲烷、乙醚等有機(jī)溶劑萃取，加酸后成鹽復(fù)溶于水這一性質(zhì)，將肺閉寧顆粒的水溶液堿化后分別用乙醚、三氯甲烷萃取，從比較的結(jié)果看，用三氯甲烷萃取易分層，且三氯甲烷液在下層，處理較為方便；用乙醚萃取，易乳化，不易分層，造成有效成分提取不完全，故選用三氯甲烷為提取溶劑。提取溶劑的用量及提取次數(shù)經(jīng)比較后，結(jié)果認(rèn)為，提取4次，加入量為20、20、15、15mL的樣品中麻黃堿與偽麻黃堿的含量最高。如何將三氯甲烷回收也是本試驗(yàn)的關(guān)鍵，如果溫度過高，由于麻黃堿與偽麻黃堿的沸點(diǎn)較低，會(huì)揮發(fā)損失，因此試驗(yàn)中選用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溫度控制在45～55℃之間比較合適。

3.2 色譜條件的選擇 由對(duì)照品溶液掃描得知，麻黃堿在210 nm、偽麻黃堿在213 nm處有最大吸收，故選擇213 nm為檢測波長，此波長處檢驗(yàn)靈敏度高，基線波動(dòng)小。

對(duì)于流動(dòng)相的選擇，由于麻黃堿與偽麻黃堿是同分異構(gòu)體，甲醇-水、乙腈-水等流動(dòng)相無法將兩種成分有效分離，本文還試驗(yàn)了乙腈-0.2%磷酸溶液（5∶95）[6]做流動(dòng)相，兩種成分的分離也不是很好，且色譜峰有拖尾現(xiàn)象，而以乙腈-水-磷酸-三乙胺（3∶97∶0.1∶0.2）為流動(dòng)相時(shí)，由于加入了三乙胺，避免了色譜峰拖尾的現(xiàn)象，同時(shí)麻黃堿與偽麻黃堿的分離度大于1.5，且主峰與雜質(zhì)峰分離效果較好，避免了雜質(zhì)對(duì)測定的影響。

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