MSCs-肝細胞共培養(yǎng)上清對體外培養(yǎng)L02細胞的影響

劉 永，胡文君，蔡家利，王英杰

1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染病研究所，重慶 400038;2.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院

目前研究表明，間充質(zhì)干細胞(MSCs)可分泌多種細胞因子，能夠促進肝細胞增殖及肝臟血管再生［1］，因此國內(nèi)不少單位已將其用于肝硬化和肝衰竭的臨床治療。實驗研究同時發(fā)現(xiàn)，移植共培養(yǎng)的MSCs-肝細胞可抑制急性肝衰竭的肝細胞凋亡，降低炎癥因子水平，改善肝生化指標(biāo)，提示MSCs聯(lián)合肝細胞移植治療肝衰竭可能更有臨床價值［2］。迄今為止，有關(guān)MSCs與肝細胞的相互作用及其共同治療肝衰竭的具體作用機制尚不十分清楚。本研究采用共培養(yǎng)策略和體外研究方法，觀察了MSCs-肝細胞共培養(yǎng)上清對L02細胞增殖和活力的影響及L02細胞損傷的保護作用，旨在為MSCs聯(lián)合肝細胞治療肝衰竭提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MSCs、肝細胞的分離與共培養(yǎng) 實驗動物SPF級SD大鼠(4～6周齡，購于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)。采用全骨髓貼壁篩選法分離MSCs，傳至第3代備用。采用體外膠原酶兩步灌注法分離肝細胞，用臺盼藍染色計數(shù)測活力，接種于6孔板，待肝細胞完全貼壁后換液。與此同時，胰酶消化第3代MSCs，計數(shù)并以1∶10的比例加入肝細胞培養(yǎng)板，共培養(yǎng)6 d。每日收集共培養(yǎng)上清，同時收集單獨培養(yǎng)的肝細胞、MSCs上清作為對照，采用500×g離心10 min和濾膜過濾的方法除去死細胞及雜質(zhì)，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 L02細胞的培養(yǎng)及細胞損傷模型的建立 常規(guī)方法復(fù)蘇L02細胞(本實驗室保存購置于上海細胞所)，采用1640加10%的新生牛血清進行常規(guī)培養(yǎng)。胰酶消化狀態(tài)良好的L02細胞，以1×104的密度接種到24孔板，將細胞培養(yǎng)液與酒精以1∶1的比例混合，倍比稀釋加入L02細胞培養(yǎng)板里，次日觀察細胞狀態(tài)，并用MTT法檢測細胞的增殖情況，以細胞半數(shù)致死量的酒精濃度作為制備細胞損傷模型的最佳濃度。

1.3 普通培養(yǎng)組L02細胞活力和總蛋白含量檢測

1.3.1 細胞活力檢測:采用MTT法檢測L02細胞活力，細胞以1×104的密度接種于24孔板，分別加入單獨培養(yǎng)的肝細胞上清、MSCs上清和MSCs-肝細胞共培養(yǎng)上清(對照組加入10%NCS)。培養(yǎng)2～3 d后吸棄上清，加入5 mg/mL的MTT液200 μL，培養(yǎng)6 h后吸棄上清，加入二甲亞砜10 min，取樣，在 Fortune labsystems酶標(biāo)儀(蘇蘭雷勃公司)490 nm波長測吸光度值。

1.3.2 總蛋白檢測:L02細胞細胞以2×104的密度接種L02細胞于12孔板，同時加入各細胞培養(yǎng)上清，48 h后消化、離心，500 μL蒸餾水重懸，－70℃反復(fù)凍融3次。每次約2～3 h，第3次凍融后離心取上清，采用考馬斯亮藍法(Bradford法)檢測L02細胞中蛋白質(zhì)的含量。

1.4 損傷培養(yǎng)組細胞活力、總蛋白含量及細胞損傷的檢測 細胞損傷次日換液，分別加入肝細胞上清、MSCs上清和肝細胞-MSCs共培養(yǎng)上清培養(yǎng)，48 h后同上方法檢測細胞活力、總蛋白含量。同時取L02細胞培養(yǎng)上清、離心，紫外動力學(xué)方法在7020型日立自動分析儀上檢測AST、LDH漏出量。按照細胞凋亡試劑盒(Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒)步驟處理樣品，流式細胞儀進行細胞凋亡率的檢測。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察 采用改良的兩步膠原酶分離肝細胞活力＞90%，培養(yǎng)后呈典型的多邊形態(tài)。采用全骨髓貼壁篩選法分離的MSCs，接種24 h換液后，可見數(shù)目較多的梭形、不規(guī)則形態(tài)細胞，傳代后細胞增殖速度加快，至第3代時，細胞呈均一的梭形排列。肝細胞與MSCs以1∶10的比例共培養(yǎng)，可見肝細胞呈島嶼狀排列分布，大部分被MSCs包圍生長(見圖1)。

圖1 原代大鼠肝細胞、MSCs以及混合培養(yǎng) A:原代24 h肝細胞(40×);B:MSCs(第3代，40×);C:第3代MSCs和肝細胞共培養(yǎng)1 d(100×)Fig 1 Primary hepatoctyes of SD rats，MSCs and the co-culture of hepatoctyes，MSCs A:Primary 24 h hepatoctyes(40 × );B:MSCs(P 3，40×);C:MSCs and hepatoctyes co-culture 1 d(100×)

2.2 共培養(yǎng)上清對普通培養(yǎng)L02細胞的影響 采用MSCs-肝細胞共培養(yǎng)上清及肝細胞上清、MSCs上清對L02細胞進行培養(yǎng)，MTT檢測結(jié)果顯示，L02細胞活力顯著升高，與對照組相比有顯著性差異，其中共培養(yǎng)上清效果最佳(P＜0.05)。總蛋白合成量檢測結(jié)果顯示共培養(yǎng)上清組及肝細胞上清、MSCs上清明顯高于對照組(P ＜0.05，見圖2)。同時檢測 AST、LDH 漏出量顯示，MSCs-肝細胞共培養(yǎng)上清組及肝細胞上清組、MSCs上清組細胞AST、LDH漏出量明顯低于對照組，且兩兩相比差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

2.3 細胞凋亡的檢測 采用流式細胞檢測細胞凋亡率，加入細胞培養(yǎng)上清作用后的L02細胞凋亡率顯著低于對照組，尤其是共培養(yǎng)組上清組細胞凋亡率最低，對照組的細胞凋亡率是共培養(yǎng)組的近4倍(見圖2)。

表1 細胞上清對損傷L02細胞AST、LDH的影響Tab 1 The effect of supernatant liquid on AST，LDH of L02

3 討論

圖2 細胞上清對體外培養(yǎng)L02生長的影響 A:普通培養(yǎng)L02活力;B:損傷后培養(yǎng)L02活力;C:普通培養(yǎng)L02總蛋白合成;D:損傷后培養(yǎng)L02總蛋白合成;E:肝細胞上清組L02細胞凋亡;F:MSCs上清組L02細胞凋亡;G:共培養(yǎng)組L02細胞凋亡;H:對照組L02細胞凋亡Fig2 The effect of supernatant liquid on the growth of L02 in vitro A:Cell viability of normal culture L02;B:Cell viability of damaged L02;C:Total protein synthesis of normal cultured L02;D:Total protein synthesis of damaged L02;E:The effect of hepatoctyes supernatant liquid on L02 cell apoptosis;F:The effect of MSCs supernatant liquid on L02 cell apoptosis;G:The effect of co-culture group supernatant liquid on L02 cell apoptosis;H:The control group of L02 cell apoptosis

近年來，隨著干細胞研究的快速發(fā)展，越來越多的研究顯示MSCs對肝臟疾病的治療有良好的前景。其中將MSCs用于治療肝衰竭的動物或臨床研究均取得一定的療效［3］。在 MSCs治療肝衰竭的研究中，將MSCs與肝細胞進行體外共培養(yǎng)是研究的熱點之一。據(jù)報道MSCs與肝細胞共培養(yǎng)既有利于肝細胞功能和活力的維持，也有助于MSCs向肝細胞分化。二者分別對肝硬化和肝衰竭具有多種有效的治療作用，包括分泌細胞因子抑制肝細胞凋亡、降低炎癥因子水平及對肝細胞功能的支持和改善生化指標(biāo)等［2］。鑒于MSCs、肝細胞對肝衰竭的治療作用可能源于某些細胞因子，猜測細胞培養(yǎng)上清可能也有一些細胞因子對肝衰竭具有治療作用。因此，本研究就MSCs-肝細胞共培養(yǎng)上清在體外對L02細胞生長和功能的影響進行初步探討，從而為肝衰竭的治療提供新的依據(jù)。

細胞的生長活力和總蛋白合成量能直接反映細胞的生長狀況，本研究也采用細胞生長活力和總蛋白合成量兩項指標(biāo)來評價細胞的生長狀況。結(jié)果顯示細胞培養(yǎng)上清對體外培養(yǎng)的L02細胞的生長都有明顯的促進作用，尤其共培養(yǎng)組上清對L02細胞的活力影響最大。為了驗證實驗結(jié)果，本實驗分設(shè)普通培養(yǎng)組和損傷培養(yǎng)組，結(jié)果顯示MSCs-肝細胞共培養(yǎng)上清對于普通培養(yǎng)的L02細胞以及酒精損傷的L02細胞都有顯著的刺激增殖作用，表現(xiàn)為L02增殖活躍，總蛋白合成量增加。該結(jié)果提示細胞培養(yǎng)上清中可能含有某種或者某一類活性物質(zhì)對細胞的活力有較為明顯的促進作用。推測這類活性成分可能是肝細胞、MSCs分泌的各種可溶性細胞因子或者生長因子。我們的實驗還發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)48 h時段的上清與其他時段的共培養(yǎng)上清相比，對L02刺激作用更為顯著，而且這種促進作用隨時間變化而呈周期性變化，這種變化與肝細胞的生長曲線相一致。這也提示了共培養(yǎng)上清中確實有某種有效成分可以刺激L02的增殖，且這種有效成分與肝細胞可能存在某種聯(lián)系。

LDH漏出量是細胞膜損傷的重要標(biāo)志，而AST是肝細胞損傷靈敏的檢測指標(biāo)。本實驗采用酒精制備細胞損傷模型，AST和LDH值顯著升高。將MSCs、肝細胞及共培養(yǎng)上清加入L02細胞損傷組培養(yǎng)一段時間后，再在相同的條件下檢測AST和LDH值，發(fā)現(xiàn)加入細胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)之后的L02細胞與對照組相比，AST和LDH有不同程度的降低，尤其是加MSCs-肝細胞共培養(yǎng)上清更為顯著。提示細胞培養(yǎng)上清能夠減輕酒精對L02細胞膜的損傷，對L02細胞損傷有保護作用。為了進一步驗證上述結(jié)果，我們采用流式細胞儀分析細胞凋亡情況，結(jié)果也證實了MSCs-肝細胞共培養(yǎng)上清可以有效地減少細胞凋亡，這與Parekkadan等的研究相一致［2，4］。

已有多項體外實驗證明MSCs可以分泌多種細胞因子如白細胞介素 IL-1、IL-6、IL-8、血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、前列腺素E2、神經(jīng)生長因子等發(fā)揮其調(diào)節(jié)免疫的作用［5-7］。肝細胞培養(yǎng)上清中亦含有減少肝細胞死亡，有效改善肝功能的有效成分［8］。我們的研究結(jié)果顯示了MSCs-肝細胞共培養(yǎng)上清有促進細胞增殖、減少細胞凋亡和保護細胞損傷的作用，且這種作用要強于單獨培養(yǎng)的肝細胞和MSCs培養(yǎng)上清，推測這種作用可能是多種細胞因子和生長因子協(xié)同作用的結(jié)果，但具體是哪一類細胞因子在起作用及其作用機制有待于進一步的研究。

［1］Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells drived from adult marrow［J］.Nature，2002，418(4):41-49.

［2］Parekkadan B，van Poll D，Suganuma K，et al.Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse sefulminant hepatic failure［J］.PLos one，2007，2(9):e941-e947.

［3］Agnieszka B，Takumi T，Yusuke Y，et al.Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure ［J］.J Gastroenterol Hepatol，2009，24(1):70-77.

［4］Parekkadan B，van Poll D，Megeed Z，et al.Immunomodulation of activated hepatic stellate cells by mesenchymal stem cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，363(2):247-252.

［5］Yu Y，Yao AH ，Chen N，et al.Mesenchymal stem cells over-expressing hepatocyte growth factor improve small-for-size liver grafts regeneration［J］.Mol Ther，2007，15(7):1382-1389.

［6］Zender L，Hutker S，Mundt B，et al.NF-κB-mediated upregulation of bcl-xlrestrains TRAIL-mediated apoptosis in murine viral hepatitis［J］.Hepatology，2005，41(2):280-288.

［7］Kharaziha P，Hellst rim PM，Noorinayer B，et al.Improvement of liver function in liver cirrhosis patient s after autologous mesenchymal stem cell injection:a phase I-II clinical trial［J］.Eur Gastroenterol Hepatol，2009，21(10):199-205.

［8］Molnar C，Garcia-Trevijano ER，Luduiczek O，et al.Antiinflammatory effects of hepatocyte growth factor:induction of interleukin-1 receptor antagnist［J］.Eur Cytokine Netw，2004，15(4):303-311.