實驗性肝硬化大鼠肝組織中CSE和Ki-67的表達及其意義

閻繼攀，鄭 勇，劉 浩，李 睿，張 寧，齊翠花，宋麗秀，陳衛(wèi)剛

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000;2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

內(nèi)源性硫化氫(H2S)是繼NO和CO之后發(fā)現(xiàn)的可以導(dǎo)致血管舒張的第3種氣體信號分子［1］。內(nèi)源性H2S產(chǎn)生依靠的兩個關(guān)鍵性酶是CBS和CSE，CBS和CSE在不同種屬不同組織中的分布不同，據(jù)報道在哺乳動物的肝臟中以CBS為主［2］，本課題組前期研究提示H2S/CSE體系對門靜脈高壓的形成起抑制作用［3］，對肝硬化起保護作用。Ki-67抗原是一種很好的增殖標(biāo)物［4］。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分別檢測實驗性肝硬化大鼠CSE及Ki-67在肝臟細(xì)胞的表達，并用免疫熒光雙染法在同一張病理切片上檢測CSE和Ki-67的表達，并探討其表達的意義。

1 資料與方法

1.1 實驗對象和分組 雌性SD大鼠48只，均購自新疆維吾爾自治區(qū)醫(yī)學(xué)實驗動物研究中心，隨機分為6組(每組8只):NF組(正常對照組)、SF組(正常H2S增加組)、PF組(正常H2S減少組)、HF組(肝硬化對照組)、SHF組(肝硬化H2S增加組)，PHF組(肝硬化H2S減少組)。

1.2 主要試劑及儀器 實驗所用CSE小鼠抗大鼠多克隆一抗購自abcam公司，Ki-67兔抗大鼠多克隆一抗購自北京博奧森生物有限公司，相關(guān)二抗及免疫熒光酶標(biāo)記抗體購自北京中山生物公司。離子計(PXS-270)、敏感硫電極(Pag/S1)購自上海雷磁公司;紫外分光光度儀:SHIMAD ZU公司生產(chǎn)UV2401-PC型;恒冷切片機:德國HM560型。

1.3 方法

1.3.1 模型制備:根據(jù)本課題組以往的經(jīng)驗，采用四氯化碳(CCl4)復(fù)合因素法制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型。即肝硬化組大鼠(皮下注射40%CCl4;以棉子油稀釋)，0.3 mL/100 g質(zhì)量 (首次劑量 mL/100 g)，每隔4天1次，給予高脂高膽固醇飼料，即前2周飼以高脂飼料，第3周開始飼以高膽固醇飼料，同時給予15%乙醇作為飲用水;正常對照組只給予相同劑量的棉子油，采用標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)法，即飼以復(fù)合飼料，飲用自來水。肝硬化大鼠造模成功后H2S增加組分別給予H2S 供體硫氫化鈉(NaHS)56 μmol·kg－1·d－1腹腔注射;H2S減少組給予同等劑量H2S代謝酶抑制劑炔丙基甘氨酸(PPG)30 mg·kg－1·d－1腹腔注射，其他組給予0.9%氯化鈉注射液l mL腹腔注射。共注射7 d。

1.3.2 門靜脈壓力的測定及標(biāo)本的留取:干預(yù)劑給予1周后測定各組實驗大鼠門靜脈壓力及留取標(biāo)本。門靜脈導(dǎo)管法測量門靜脈壓力，應(yīng)用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，固定在操作臺上。在劍突下行腹部正中切口，將小腸左下拉下暴露門靜脈主干，用5.5號頭皮針進行門靜脈穿刺固定，連接壓力換能器，應(yīng)用十二道生理記錄儀測量門靜脈壓力(PVP)。PVP＞12 mmHg為肝硬化造模成功。取門靜脈血，低溫高速離心機離心分離獲得血漿，置于－80℃冰箱保存;取大鼠門靜脈及部分肝組織于10%甲醛溶液中固定，送病理科作石臘包埋，超薄切片機切片，厚度為4 mm。其余肝組織置于－80℃冰箱保存。

1.3.3 標(biāo)本留取及門靜脈血漿硫化氫的測定:門靜脈血漿中H2S含量測定采用敏感硫電極法。取新鮮血漿0.5 mL，加入等體積抗氧化液混勻后，采用PXS-270型離子計測定硫離子含量，根據(jù)S2標(biāo)準(zhǔn)曲線計算H2S的含量。

1.3.4 免疫組化方法:石蠟標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片，免疫組化采用SP法，石蠟切片置0.01 mmol/L檸檬酸緩沖液微波修復(fù)抗原，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、顯微鏡下觀察。已知陽性片作陽性對照，PBS替代一抗作陰性對照。顯微鏡下觀察。

1.3.5 免疫熒光方法:使用進口優(yōu)化的切片連續(xù)切片厚度為8 μm。采用丙酮同定15 min，PBS沖洗3次，5 min/次;滴加1 mL山羊血清，常溫放置20 min后;滴加一抗(Ki-67及CSE)4℃孵育過夜;次日PBS沖洗3次，5 min/次;滴加熒光二抗室溫放置2 h，PBS沖洗3次，5 min/次，50%甘油封片。熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3.6 CSE表達水平的評判方法:每張切片在高倍鏡下隨機選擇5個視野，棕黃色為陽性，每個視野記數(shù)200個細(xì)胞，共計1000個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞數(shù)。切片的觀察和計數(shù)均由資深病理科醫(yī)生完成，以二者結(jié)果的均數(shù)為表達的陽性數(shù)。Ki-67細(xì)胞核呈棕色顆粒為陽性，先在低倍鏡下觀察Ki-67染色情況，尋找染色較密者，分布均勻區(qū)域，隨機取5個高倍鏡視野(10×40)，計數(shù)500個細(xì)胞中Ki-67陽性細(xì)胞核數(shù)，平均每100個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞核數(shù)為Ki-67標(biāo)記指數(shù)，即:Ki-67 LI=［Ki-67(+)細(xì)胞核/500個細(xì)胞核］×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理以SPSS 17.0統(tǒng)計軟件完成。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠的肝組織病理學(xué)觀察 肉眼觀，可見NF組大鼠肝組織表面光滑，質(zhì)軟，色澤暗紅，邊緣銳，體積形態(tài)正常;HF組肝組織體積縮小，體質(zhì)量減輕，質(zhì)地變硬，顏色變淺，邊緣變鈍，表面有大小不等的結(jié)節(jié)。顯微鏡下見:NF組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊;HF組大鼠見正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維結(jié)締組織增生，假小葉形成。

2.2 各組肝硬化大鼠門靜脈壓力 HF組、PHF組、SHF組的門靜脈壓力均高于NF組(P＜0.01)，與HF組相比，PHF、SHF門靜脈壓力均降低(P＜0.01);表明給予抑制劑或H2S供體對正常對照組壓力無顯著影響，能使肝硬化大鼠門靜脈壓力降低(見表1)。

2.3 門靜脈血漿H2S含量測定 HF組H2S含量明顯低于NF組(P＜0.01)，在正常對照組或肝硬化模型組中，給予H2S供體均能使H2S含量升高(P＜0.01)，給予H2S供體使H2S含量進一步升高(P＜0.01，見表1)。

2.4 免疫組化結(jié)果 免疫組化法CSE和Ki-67的表達:CSE定位在細(xì)胞漿，陽性細(xì)胞可見細(xì)胞核染色為棕褐色或棕黃色，與被蘇木素襯染成藍色的陰性胞核區(qū)別明顯。Ki-67陽性細(xì)胞散在纖維間隔內(nèi)或其周圍，呈單個或散在不規(guī)則分布，陽性物質(zhì)位于核內(nèi)，呈棕黃色免疫組化染色結(jié)果(見圖1、圖2)。

表1 各組大鼠門靜脈壓力(PVP)及H2S含量變化()Tab 1 Changes of PVP and H2S in every group()

表1 各組大鼠門靜脈壓力(PVP)及H2S含量變化()Tab 1 Changes of PVP and H2S in every group()

注:與 NF組相比，*P ＜0.01;與 HF組相比，▲P＜0.01

組別 例數(shù) PPV(mmHg) H2S含量(μmol/L)NF 8 9.84 ±1.09 180.33 ±11.71 PF 8 9.16 ±1.17 189.93 ±1.94*SF 8 8.85 ±1.28 189.66 ±5.53*HF 8 16.08 ±1.16* 134.49 ±12.25*PHF 8 14.13 ±0.56＊▲ 160.82 ±6.79▲SHF 8 13.95 ±1.31＊▲ 151.19 ±8.75▲

HF組CSE表達明顯低于NF組(P＜0.01)，PHF組硫化氫表達較SHF組均減少(P＜0.01)。HF組Ki-67表達明顯高于NF組(P＜0.01)，PHF組硫化氫表達較SHF組增加(P＜0.01)。Ki-67表達在正常大鼠無明顯作用(見表2)。

圖1 PHF組肝組織CSE(DAB 200×);圖2 SF組肝組織Ki-67(DAB 200×)Fig 1 CSE of liver tissue in PHF group(DAB 200×);Fig 2 Ki-67 of liver tissue in SF group(DAB 200×)

表2 各組大鼠CSE及Ki-67的表達Tab 2 Expression of CSE and Ki-67 in every group

2.5 免疫熒光 圖3A為CSE單染圖片，為綠色胞漿著色。圖3B為Ki-67單染圖片，為紅色胞核著色，圖3C為Ki-67和CSE雙染結(jié)果。

3 討論

H2S作為重要的新型氣體信號分子參與調(diào)節(jié)平滑肌的舒張功能，已經(jīng)證明了內(nèi)源性H2S水平的降低在自發(fā)性高血壓的形成、心血管系統(tǒng)功能與結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)上起了重要的作用［6］;能降低肝硬化門靜脈壓力。

圖3 SHF組免疫熒光(400×)A:CSE;B:Ki-67;C:CSE/Ki-67Fig 3 Immunofluorescence in SHF group(400×)A:CSE;B:Ki-67;C:CSE/Ki-67

Ki-67是一類新的與細(xì)胞周期相關(guān)的細(xì)胞核非組織蛋白［6-9］，因此，Ki-67可作為標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的抗原，陽性說明細(xì)胞增殖活躍。本研究顯示，在正常大鼠肝臟中CSE的表達與Ki-67的表達各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。在肝硬化大鼠中CSE的表達與Ki-67的表達呈負(fù)相關(guān)，既增加硫化氫的供體，CSE的表達增加;Ki-67的表達減少;給予大鼠硫化氫抑制劑，CSE的表達減少;Ki-67的表達增加。CSE與Ki-67免疫熒光雙染提示兩個指標(biāo)之間存在一定的關(guān)系，根據(jù)免疫組化和免疫熒光雙染結(jié)果提示H2S能夠抑制實驗性肝硬化大鼠細(xì)胞的增殖。

肝硬化的機制非常復(fù)雜，肝細(xì)胞的炎癥、壞死、免疫反應(yīng)、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化，脂質(zhì)過氧化物的大量外溢，TGF-β、PDGF等多種細(xì)胞因子，均參與了這一過程［10-11］。Fiorucci等［12］近期又發(fā)現(xiàn)CSE在肝細(xì)胞和星狀細(xì)胞內(nèi)表達，而竇細(xì)胞則不表達，星狀細(xì)胞活化時，CSE mRNA表達下調(diào)，CSE含量降低，H2S的合成減少，由于H2S能夠抑制Ⅰ、Ⅲ型前膠原的合成，因此星狀細(xì)胞H2S的減少對Ⅰ、Ⅲ型膠原的抑制也降低，這在肝硬化和門脈高壓的形成中具有重要意義。肝星狀細(xì)胞HSC的增生激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。由此，結(jié)合本次實驗病理切片形態(tài)學(xué)觀察我們推測H2S可能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，從而對肝硬化起到一定的保護和修復(fù)受損肝臟的作用。

本課題組前期研究H2S能降低不同時期肝硬化門靜脈壓力［13］。H2S通過舒張血管平滑肌，降低體動脈壓［14］;有研究推測［15］H2S 可抑制平滑肌細(xì)胞增殖，可以在分子水平直接調(diào)節(jié)血管平滑肌張力，降低血壓。本研究中，在免疫組化病理切片中我們可以發(fā)現(xiàn)在PHF組肝臟門靜脈匯管區(qū)血管Ki-67表達增高;而SHF組肝臟門靜脈匯管區(qū)血管Ki-67表達明顯降低，由此我們推測H2S可以直接抑制肝臟門靜脈的血管平滑肌細(xì)胞的增殖從而降低門靜脈壓力，對肝硬化起到保護性作用。

綜上所述，本組資料提示H2S能夠抑制實驗性肝硬化大鼠肝臟組織內(nèi)細(xì)胞的增殖。結(jié)合病理切片形態(tài)學(xué)觀察我們推測，硫化氫抑制的大鼠增殖細(xì)胞可能是肝星狀細(xì)胞和肝臟門靜脈匯管區(qū)血管平滑肌細(xì)胞。但是證實是否是這兩種細(xì)胞增殖及通過何種機制起到抑制增殖的作用，還需進行進一步研究證實。本實驗表明在肝硬化中隨著H2S的增加細(xì)胞增殖能力明顯加強。說明H2S能夠在一定范圍內(nèi)抑制肝細(xì)胞的增殖，減少肝細(xì)胞損傷，提高肝細(xì)胞的生存能力，對肝硬化具有一定的保護作用，也為H2S在臨床上用于肝硬化的治療提供了理論和實驗依據(jù)，為繼續(xù)研究其抗肝硬化作用打下了理論基礎(chǔ)。

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