EGCG經(jīng)NF-кB途徑抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖的研究

方志雄，程 丹，羅招陽

1.湖南湘潭市中心醫(yī)院肝病科，湖南 湘潭 411100;2.湖北黃石市傳染病院肝病科;3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病呈逐年上升趨勢［1］。由于其早期癥狀不明顯，大部分患者就診時已為晚期，因此，化療成為肝癌治療的重要手段［2］。然而，許多患者因無法耐受化療藥物的毒副作用，致使臨床療效難盡人意［3］。因此，尋找有效、低毒的抗癌藥物，成為腫瘤研究的熱點之一。本文旨在初步探討EGCG抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 肝癌HepG2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，用含10%小牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品)的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 EGCG EGCG為美國Sigma公司產(chǎn)品(純度﹥98%)，將其溶于PBS溶液中，過濾除菌后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 繪制細(xì)胞生長曲線 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，按2×103個/孔接種于24孔板，加入 EGCG至50.0 mg·L－1(≈IC50值，PBS 為陰性對照組)，每組設(shè)3個平行孔。每天取3孔計數(shù)細(xì)胞，每孔計數(shù)3次，計算細(xì)胞數(shù)的均值，連續(xù)6 d，繪制EGCG抑制HepG2細(xì)胞的生長曲線。

1.4 平板克隆形成實驗 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，按500個/孔接種于6孔板中，加入EGCG至50.0 mg·L－1(≈IC50值，PBS為陰性對照組)，每組設(shè)3個平行孔。培養(yǎng)2周后取出培養(yǎng)皿，甲醇固定后，0.4%結(jié)晶紫染色，計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，按公式計算EGCG抑制HepG2細(xì)胞的抑制率IR:抑制率IR(%)=［1－(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))］×100%。

1.5 軟瓊脂集落實驗 用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基、0.6%瓊脂糖配制底層瓊脂，取2 mL鋪于6孔板內(nèi)，然后用HepG2細(xì)胞(密度為2×104個細(xì)胞/孔)、50.0 mg·L－1EGCG 培養(yǎng)液(≈IC50值)、0.3%瓊脂糖配制頂層瓊脂，每組設(shè)3個平行孔，37℃，5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)2周后，計數(shù)集落數(shù)和抑制率IR值:抑制率IR(%)=［1－(處理組集落均數(shù)/陰性對照組集落均數(shù))］×100%。

1.6 Western blot檢測蛋白表達 取對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞，加入 EGCG 至 50.0 mg·L－1(≈IC50值，PBS為陰性對照組)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，裂解，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度，以各泳道30 μg的總蛋白量進行10%SDS不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗(1∶1000)室溫孵育濾膜1 h，PBS洗膜，HRP標(biāo)記的二抗(1∶1000)室溫孵育濾膜1 h，洗膜后進行ECL化學(xué)發(fā)光、X光片曝光并顯影、定影，分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理所有的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用表示，所有的數(shù)據(jù)均采用χ2和T-test法進行分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG抑制HepG2細(xì)胞增殖的生長曲線 每天計數(shù)細(xì)胞數(shù)，觀察EGCG抑制HepG2細(xì)胞增殖的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組比較，EGCG處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞生長減慢(n=3，P＜0.05)，說明 EGCG可有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖，隨著作用時間的延長，HepG2細(xì)胞增殖抑制作用更顯著(見圖1)。

圖1 EGCG抑制HepG2細(xì)胞增殖的生長曲線 (與對陰性照組比較，#P ＜0.05)Fig 1 Growth curve of EGCG inhibited the proliferation of HepG2 cells

2.2 EGCG對HepG2細(xì)胞平皿克隆形成的抑制作用 結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，EGCG處理組細(xì)胞克隆體積小，數(shù)目少，說明EGCG可有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖(見圖2、表1)。

表1 EGCG處理后HepG2細(xì)胞的平皿克隆數(shù)統(tǒng)計Tab 1 Clonal number of HepG2 cells dealt with EGCG

2.3 EGCG對HepG2細(xì)胞集落形成的抑制作用取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，通過軟瓊脂集落形成實驗觀察EGCG處理HepG2細(xì)胞后的集落形成情況。結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，EGCG處理組的細(xì)胞集落體積小，數(shù)目少，說明EGCG對HepG2細(xì)胞集落形成具有抑制作用(見圖3、表2)。

表2 EGCG處理后HepG2細(xì)胞的集落形成數(shù)統(tǒng)計()Tab 2 Statistics of EGCG inhibited cell colony forming number of HepG2 cell

表2 EGCG處理后HepG2細(xì)胞的集落形成數(shù)統(tǒng)計()Tab 2 Statistics of EGCG inhibited cell colony forming number of HepG2 cell

與陰性對照組比較，#P＜0.05

分組 軟瓊脂集落形成數(shù)()抑制率(%)陰性對照組926 ±146 4.63 EGCG處理組 624±112#3.12

2.4 EGCG 處理后 HepG2細(xì)胞中 NF-кB P65蛋白的表達 結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，EGCG處理后NF-кB P65蛋白表達降低(見圖4)，提示EGCG可能通過抑制NF-кB P65蛋白表達而發(fā)揮抑制HepG2細(xì)胞的增殖。

圖4 Western blot檢測EGCG處理后HepG2細(xì)胞中NF-кB P65蛋白的表達 A:陰性對照組;B:50.0 mg·L－1EGCG處理組Fig 4 Detection of the expression of NF-кB P65 protein in HepG2 cells inhibited by EGCG with Western blot A:negative control;B:50.0 mg·L－1EGCG group

3 討論

眾所周知，大多數(shù)天然植物具有低毒性的特點，從天然植物中分離和篩選抗腫瘤的有效成分，并探討其抗腫瘤作用機制，為當(dāng)前腫瘤藥物學(xué)的研究熱點之一。近年來，從不少天然植物中篩選的有效成分能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這為臨床防治腫瘤提供了新的思路，如從喜樹中篩選的羥基喜樹堿［4］，三尖杉中分離的三尖杉酯堿［5］等能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。

茶作為廣泛流行和人們喜好的三大飲料之一，可有效預(yù)防和治療多種腫瘤。茶作為天然植物的抗腫瘤作用，是目前腫瘤防治領(lǐng)域中的熱點之一，尤其是綠茶的研究最多。綠茶的多種成分具有多種生物活性和有效的抗腫瘤作用，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯［(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG］含量最高，生物活性最強，抗腫瘤作用也最明顯［6-9］。我們首先通過MTT法檢測了EGCG抑制HepG2細(xì)胞增殖的IC50值為50.24 mg·L－1(結(jié)果沒有顯示)，在后續(xù)的實驗研究中，選取50 mg·L－1EGCG作為近似的IC50值。

腫瘤細(xì)胞集落形成能力是腫瘤重要的惡性特征之一，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，是體外篩選抗腫瘤藥物的重要方法。我們通過細(xì)胞生長曲線、平皿克隆和軟瓊脂集落形成實驗檢測了EGCG抑制HepG2細(xì)胞的增殖作用，研究結(jié)果顯示EGCG能有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖，這與以往許多報道EGCG的抑瘤作用基本相似相似［7-9］。

核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)是一個高度保守的重要轉(zhuǎn)錄因子家族，1986年由Sen和Bakimore首次報道，因參與B細(xì)胞κ輕鏈的表達調(diào)控而得名。NF-κB形成同源或異源性二聚體發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能，p65和p50是其最重要的兩個亞基［10］。調(diào)控NF-κB激活的信號通路有兩種:一種是IκB依賴性經(jīng)典途徑;另一種是非經(jīng)典途徑。在經(jīng)典途徑中，NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)在外源性刺激下被磷酸化和泛素化，從p50/p65異二聚體/IκBα復(fù)合物中解離下來，p50/p65異二聚體便通過核膜轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的9～11個核苷酸構(gòu)成的κB結(jié)合位點結(jié)合誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄［11］。為進一步了解EGCG抑制HepG2細(xì)胞增殖的具體機制，采用Western blot檢測了EGCG處理前后HepG2細(xì)胞中NF-кB P65蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，EGCG處理后HepG2細(xì)胞中NF-кB P65蛋白的表達降低。結(jié)合EGCG能有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖作用，我們推測EGCG抑制NF-кB P65蛋白表達可能是其發(fā)揮抑制HepG2細(xì)胞增殖的機制之一，其中可能涉及NF-кB P65蛋白調(diào)控的復(fù)雜信號網(wǎng)路，仍有待我們進一步深入研究。

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